《Water Biology and Security》：Mutation of
cfap58 causes sperm malformation and reduced fertility in zebrafish
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成熟精子在鱼类繁殖中发挥关键作用，直接影响后代的存活与质量。纤毛和鞭毛相关蛋白58（cilia- and flagella-associated protein 58，cfap58）定位于运动型纤毛，是精子鞭毛组装和雄性生育力所必需的。CFAP58缺陷可导致严
成熟精子在鱼类繁殖中发挥关键作用，直接影响后代的存活与质量。纤毛和鞭毛相关蛋白58（cilia- and flagella-associated protein 58，cfap58）定位于运动型纤毛，是精子鞭毛组装和雄性生育力所必需的。CFAP58缺陷可导致严重的多发性精子鞭毛形态异常（multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF），在哺乳动物中表现为精子鞭毛畸形和运动能力受损。然而，现有研究多集中于哺乳动物，对鱼类中cfap58的功能知之甚少。本研究以斑马鱼为模式生物，探讨cfap58对鱼类生育力的影响。通过CRISPR/Cas9技术获得的携带cfap58突变的精子，其受精率和胚胎存活率显著降低。突变精子的鞭毛形态异常，保守的“9 + 2”微管结构被破坏，线粒体形态异常，精子运动能力显著下降。研究人员还观察到cfap58?/?精巢中未分化生殖细胞比例显著增加。精巢单细胞转录组测序揭示，cfap58?/?中参与多个纤毛和微管相关通路的基因出现广泛失调。数据表明，cfap58在斑马鱼精子成熟和生育力维持中发挥重要作用。此外，研究人员提出cfap58可能参与放射辐（radial spoke）的组成，并有助于维持精子鞭毛内转运（intraflagellar transport，IFT）的正常功能。
**cfap58在斑马鱼精子发生与生育力维持中的功能研究**
**一、研究背景与科学问题**
精子发生（spermatogenesis）是鱼类雄性生育力的核心生物学过程，在 aquaculture、物种保护和进化生物学中具有重要研究价值。在脊椎动物中，精子发生可分为有丝分裂期、精原细胞期和减数分裂期三个阶段，减数分裂后的单倍体精子细胞需经历核浓缩、鞭毛和顶体形成、胞质清除等一系列程序化转变，最终分化为成熟精子。在这一过程中，鞭毛的组装尤其关键，其依赖于细胞内核合成的轴丝蛋白被运输至鞭毛远端，这一过程由鞭毛内转运（intraflagellar transport，IFT）复合体介导，其中IFT-B复合体负责将轴丝组分从胞质顺行运输至鞭毛末端。若该过程发生缺陷，将导致轴丝组装异常，进而引发精子鞭毛结构畸形和运动功能障碍。
多发性精子鞭毛形态异常（multiple morphological abnormalities of the flagella，MMAF）是一种严重的弱畸精子症，其典型特征包括鞭毛缺失、短鞭毛、卷曲鞭毛、弯曲鞭毛或鞭毛直径不规则，最终导致精子运动能力严重受损。在哺乳动物中已鉴定出多个与MMAF相关的基因，如CFAP43、CFAP44等。CFAP58（cilia- and flagella-associated protein 58）是一种在睾丸中富集的保守蛋白，对精子鞭毛组装和雄性生育力至关重要。在人类和小鼠中，CFAP58缺陷会破坏轴丝“9 + 2”微管结构，导致线粒体鞘排列紊乱，引发MMAF表型，表现为短鞭毛、卷曲鞭毛或鞭毛缺失，最终导致雄性不育或生育力严重下降。然而，现有研究几乎全部集中于哺乳动物，鱼类中cfap58的功能尚不明确。鉴于鱼类与哺乳动物在精子结构和生殖策略上存在显著差异，有必要在鱼类模型中系统研究cfap58的功能，以揭示其在进化上的保守性和物种特异性。
**二、研究内容与主要技术方法**
本研究以斑马鱼（Danio rerio）为模型，开展了以下工作：研究人员首先通过5′/3′快速扩增cDNA末端（RACE）技术克隆了cfap58全长cDNA，并利用多序列比对、系统发育分析和共线性分析对cfap58进行了分子鉴定。随后，采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在cfap58第4外显子设计引导RNA（gRNA），通过显微注射构建了cfap58基因敲除斑马鱼品系。通过免疫荧光、Western blot和qPCR验证了敲除效果，确认Cfap58蛋白完全缺失。在表型分析层面，研究人员利用苏木精-伊红（H&E）染色、TUNEL凋亡检测、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察了精巢组织学、精子鞭毛超微结构和线粒体形态。通过计算机辅助精子分析（CASA）系统评估了精子运动参数（包括平均路径速度VAP、直线运动速度VSL和曲线运动速度VCL），并通过自然交配实验测定了受精率和胚胎存活率。此外，研究人员对野生型（WT）和cfap58
?/?精巢进行了单细胞转录组测序（scRNA-seq），结合生物信息学分析揭示了差异表达基因及其富集的生物学通路。样本来源于120 dpf（days post fertilization）成体斑马鱼精巢，每种基因型取5个生物学重复。
**三、主要研究结果**
**3.1 cfap58的鉴定与分子特征**
克隆获得的斑马鱼cfap58转录本编码884个氨基酸，与参考序列（NP_001071024.4）相比存在两个氨基酸差异，但卷曲螺旋（coiled-coil，CC）结构域序列完全一致。Cfap58氨基酸序列在鱼类中高度保守，斑马鱼与银鲫（Carassius gibelio）的相似性为86.55%，与黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）为80.99%，均高于与小鼠（Mus musculus）的相似性（62.15%）。系统发育分析显示，鲤科鱼类的Cfap58聚为一支，鲶形目鱼类聚为另一支。斑马鱼cfap58基因包含18个外显子和17个内含子，定位于1号染色体，与人类、小鼠和鸡相比，斑马鱼1号染色体保留了大部分同源基因，共线性分析支持其进化保守性。
**3.2 cfap58敲除斑马鱼的构建与验证**
通过CRISPR/Cas9技术在cfap58第4外显子引入5 bp缺失突变，该突变在蛋白水平上导致提前终止密码子，产生截短蛋白并破坏CC结构域。免疫荧光实验显示，在WT精子中Cfap58沿整个鞭毛分布，与α-tubulin信号呈交错排列；而在cfap58
?/?精子中，tubulin信号仍沿鞭毛全长存在，但无Cfap58信号。Western blot和qPCR进一步确认了Cfap58蛋白的完全缺失和cfap58转录水平的显著下调。
**3.3 cfap58表达的性别二态性**
cfap58是一个雄性偏向基因，在所检测的各发育阶段（30、45、60、120和180 dpf）中，其在精巢中的表达量均显著高于卵巢。在精巢发育过程中，cfap58转录水平逐渐升高，在120 dpf达到峰值，180 dpf时有所下降。在120 dpf成体中，cfap58在精巢中的表达显著高于其他组织。免疫荧光共定位分析显示，Cfap58信号特异性地定位于晚期精子细胞中，而Vasa标记的早期生殖细胞（精原细胞和精母细胞）中无Cfap58信号。
**3.4 cfap58
?/?精巢中生殖细胞凋亡增加**
组织学分析显示，在28、35、60和90 dpf时，WT和cfap58
?/?精巢形态无明显差异。但在120 dpf时，cfap58
?/?精巢中成熟精子分布稀疏，而精原细胞和精母细胞占主导。TUNEL凋亡检测显示，cfap58
?/?精巢中凋亡信号显著增加，主要富集于精子区，阳性精子比例为0.44%，显著高于WT的0.07%。此外，突变精子线粒体膜电位（MMP）显著下降，高MMP群体比例仅为64.98%，而WT为89.62%。
**3.5 cfap58缺陷导致雄性生育力降低**
精子浓度和性腺指数（GSI）在WT和cfap58
?/?之间无显著差异。然而，cfap58
?/?精子的运动能力显著受损：运动精子比例（22.23% vs 70.67%）和进行性运动精子比例（16.99% vs 54.47%）显著降低，而静止精子比例（77.77% vs 29.23%）显著升高。同时，VAP、VSL和VCL三个运动学参数均显著下降。自然交配实验显示，cfap58
?/?雄鱼的受精率（75.49%）和胚胎存活率（35.70%）均显著低于WT（95.68%和94.60%）。
**3.6 cfap58缺陷导致精子鞭毛畸形**
SEM分析显示，cfap58
?/?精子出现鞭毛缺失、卷曲鞭毛和环状鞭毛等形态异常，其中环状鞭毛最为常见（19.93%），鞭毛缺失次之（9.28%），而WT中异常精子比例仅为9.09%。TEM进一步揭示，cfap58
?/?精子轴丝结构严重紊乱：34%的突变精子存在结构异常，其中22%表现为外周微管双联体（ODT）数量异常，8%为ODT排列紊乱，4%为中心微管对（CP）数目异常。此外，多数突变精子的外动力蛋白臂（ODA）存在不同程度的缺失。线粒体方面，突变精子表现出线粒体肿胀、嵴结构破坏或缺失，部分精子中可见自噬体。
**3.7 单细胞转录组揭示cfap58参与鞭毛组装**
通过scRNA-seq分析，在WT和cfap58
?/?精巢中分别鉴定出10,755和11,508个高质量单细胞转录组，聚类得到六种细胞群体：精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞、长形精子细胞、Leydig细胞和支持细胞。与WT相比，cfap58
?/?精巢中精母细胞、圆形精子细胞和长形精子细胞比例显著降低，而精原细胞比例显著升高，与H&E结果一致。差异表达基因分析显示，在长形和圆形精子细胞中上调的基因显著富集于纤毛组装、微管运动等通路；圆形精子细胞中下调的基因则富集于热应激反应和线粒体功能相关通路。qPCR验证了鞭毛组装相关基因（如dnai1、ccdc114、ccdc39、drc1、ift81、mks1、rsph4a、rsph14、ttll3）在突变精巢中显著上调，同时cyp26b1在长形精子细胞中显著上调，而nr5a1b和spag8显著下调。
**四、讨论与结论**
本研究在斑马鱼中证实了cfap58在精子鞭毛组装和生育力维持中的关键作用，其表型与哺乳动物中的MMAF特征高度相似，但严重程度明显较轻。在哺乳动物中，CFAP58缺陷导致精子浓度显著下降、运动能力完全丧失且100%的精子出现形态异常，最终导致完全不育；而斑马鱼cfap58
?/?的精子浓度无显著变化，约22%的精子仍保持运动能力，约32.65%的精子存在形态异常，生育力虽有显著下降但未完全丧失。这种差异可能源于鱼类和哺乳动物精子结构和生殖策略的根本不同：哺乳动物精子具有高度特化的中段和富含线粒体鞘及外周致密纤维（ODF）的复杂结构，而斑马鱼精子缺乏这些附属结构，鞭毛组织相对简单，因此cfap58缺失引发的结构缺陷范围更有限。此外，鱼类体外受精依赖短暂但快速的精子运动，而哺乳动物体内受精需要持续的运动能力，这种生理需求差异也可能导致表型差异。
单细胞转录组分析显示，cfap58缺陷导致鞭毛组装相关基因的广泛失调，提示可能存在补偿性转录调控机制。同时，圆形精子细胞中热休克蛋白（hsp70、hsp90）的下调以及线粒体功能障碍的富集，表明cfap58缺失可能通过干扰蛋白质稳态和线粒体功能促进生殖细胞凋亡。本研究还发现cfap58可能参与放射辐的组成和IFT功能的维持，为理解精子鞭毛装配的分子机制提供了新见解。
综上所述，本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了cfap58缺失斑马鱼模型，结合组织学、超微结构、运动学分析和单细胞转录组测序，系统阐明了cfap58在鱼类精子成熟和生育力维持中的保守功能。研究结果不仅丰富了MMAF的遗传病因学认识，也为鱼类养殖中雄性繁殖力评估提供了潜在分子标记。
