石斑鱼DHCR24通过Tollip介导的STING与TBK1自噬性降解发挥促病毒活性

《Water Biology and Security》：Grouper DHCR24 exerts pro-viral activity through Tollip-mediated autophagic degradation of STING and TBK1

　　

胆固醇代谢在病毒感染期间调节先天抗病毒免疫中具有重要作用，然而酶类调控干扰素（IFN）信号通路的分子机制尚不清楚。研究人员探究了石斑鱼（Epinephelus coioides）胆固醇合成关键酶3β-羟基固醇-Δ24还原酶（DHCR24，即EcDHCR24）在新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）感染中的潜在功能。SGIV孵育后，石斑鱼脾脏（GS）细胞中EcDHCR24表达显著上调。EcDHCR24过表达显著增强GS细胞中SGIV复制，并在体外抑制IFN刺激基因（ISGs）的mRNA水平；一致地，EcDHCR24沉默产生相反效应。EcDHCR24过表达也降低了由sting、tbk1、irf3和irf7诱导的这些ISGs表达水平。此外，作为内质网定位蛋白，EcDHCR与STING和TBK1相互作用。机制上，EcDHCR24以剂量依赖方式通过自噬-溶酶体途径增强STING和TBK1的降解。值得注意的是，EcDHCR24还与Toll相互作用蛋白（Tollip）相互作用，EcTollip过表达促进EcDHCR24介导的STING和TBK1降解。综上，研究人员首次揭示鱼类DHCR24通过Tollip介导的STING-TBK1轴自噬性降解负调控干扰素激活，为DHCR24调控鱼类病毒感染的机制提供了新见解。

研究背景与立项依据：胆固醇不仅是细胞膜关键组分，也是类固醇激素和胆汁酸前体，其代谢被病毒广泛劫持以利存活；病毒进入、复制、组装与释放均高度依赖胆固醇。近年研究发现胆固醇合成与代谢相关蛋白（如胆固醇25-羟化酶CH25H、DHCR24）可调控宿主IFN应答，其中哺乳类DHCR24被报道通过与MAVS或STING互作、抑制K27连接泛素化来促进VSV、HSV复制。然而硬骨鱼DHCR24在病毒感染中是否具类似功能未知。石斑鱼是我国重要海水养殖鱼类，常受SGIV（Ranavirus属大型DNA病毒，稚鱼死亡率超90%）威胁；前期表明胆固醇耗竭不影响SGIV进入，但CH25H、IFITM1等胆固醇代谢相关免疫分子可调控SGIV复制。因此，研究人员以石斑鱼DHCR24（EcDHCR24）为对象，探究其能否通过调节STING-TBK1通路影响SGIV感染与IFN免疫，该工作发表于《Water Biology and Security》。

主要技术方法：研究以实验室保存的石斑鱼脾脏（GS）细胞及扩增保存的SGIV病毒库为材料，综合采用qPCR与Western blotting检测基因转录及蛋白丰度，双荧光素酶报告系统评估IFN1与ISRE启动子活性，TCID₅₀法测定子代病毒滴度；利用GFP/RFP标记质粒共转染结合激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位与共定位；通过Co-IP验证蛋白互作；借助特异性结构域缺失突变体（STING-ΔN/ΔC、TBK1-ΔN/ΔC）界定互作区域；以MG132、3-MA、NH₄Cl分别阻断泛素-蛋白酶体、自噬或自噬-溶酶体途径，判定降解机制；并采用siRNA敲低EcDHCR24或EcTollip进行功能回复验证。

研究结果：

3.1 EcDHCR24在SGIV感染体外发挥促病毒因子作用：克隆获得1551 bp ORF（含FAD结合域），SGIV感染诱导其mRNA上调；过表达EcDHCR24加重CPE、提升mcp/vp19转录与蛋白及TCID₅₀滴度，siRNA敲低则反向抑制，证实其为促SGIV因子。

3.2 EcDHCR24负调控STING与TBK1诱导的IFN应答：过表达剂量依赖性抑制IFN1/ISRE荧光素酶活性及irf3、isg15、isg56、mxI、viperin、tbk1等转录；敲低则升高；共转EcSTING/EcTBK1/EcIRF3/EcIRF7时，EcDHCR24特异性削弱STING与TBK1（而非IRF3/IRF7）驱动的IFN/ISRE激活及ISG表达。

3.3 EcDHCR24主要定位于内质网：与ER标记DsRed完全重叠，部分与高尔基体重叠，少量与线粒体共定位，判定为ER关联蛋白。

3.4 EcDHCR24在体外与STING和TBK1互作：Co-IP与共聚焦证明结合STING/TBK1而不结合IRF3/IRF7；结构域缺失实验显示不依赖STING的N端跨膜区或C端、也不依赖TBK1的N端激酶域或C端，互作不受单一结构域删除影响。

3.5 EcDHCR24经自噬-溶酶体途径降解EcSTING与EcTBK1：过表达呈剂量依赖降低外源STING/TBK1蛋白量；MG132轻微缓解，3-MA与NH₄Cl显著阻断降解，排除蛋白酶体途径，锁定自噬-溶酶体途径。

3.6 EcTollip参与EcDHCR24介导的STING-TBK1降解：在NDP52、OPTN、p62、Tollip四种自噬 cargo受体中，EcDHCR24仅与EcTollip互作；siRNA敲低EcTollip明显减弱EcDHCR24对STING/TBK1的降解效应，确认Tollip为选择性自噬受体。

讨论浓缩：DHCR24催化24-脱氢胆固醇至胆固醇最后一步，既往哺乳类研究提示其促病毒依赖胆固醇合成或抑制MAVS/STING泛素化；本研究在鱼类中发现新机制——EcDHCR24定位于ER，被SGIV诱导后通过与STING/TBK1直接互作，招募Tollip作为自噬受体，将STING-TBK1轴递交自噬-溶酶体降解，从而关闭cGAS/STING下游I型IFN与ISG表达，助长SGIV复制。该机制不同于人DHCR24（互作区域限于STING 161–220 aa、不涉及TBK1），体现鱼类特异性。讨论还类比SGIV VP131、FTR14、VP088等病毒/宿主蛋白劫持自噬受体（p62、Tollip）降解STING/TBK1的已知现象，将EcDHCR24归入“宿主代谢酶被病毒诱导并转化为免疫抑制节点”范式。

结论翻译：简而言之，研究人员发现EcDHCR24受SGIV刺激诱导并在体外增强SGIV感染；EcDHCR24与STING和TBK1互作，通过自噬-溶酶体途径促进二者降解；Tollip是参与EcDHCR24介导STING/TBK1降解的主要选择性自噬受体。该结果为石斑鱼DHCR24通过调控IFN应答促进病毒复制提供了新证据。