衰老生长激素受体敲除小鼠的性别特异性昼夜节律和行为表型

《GeroScience》：Sex-specific circadian and behavioral phenotypes in aged growth hormone receptor knockout mice

　　

生长激素（GH）对代谢、认知及整体生理健康发挥复杂作用，其分泌受昼夜节律钟高度调控。生长激素受体敲除（GHR-KO）小鼠是一种GH不敏感模型，以循环GH持续升高为特征，为研究衰老过程中GH信号破坏的后果提供了独特机会。鉴于昼夜节律性与GH分泌之间的密切关系，研究人员调查了老龄GHR-KO小鼠在不同光暗（LD）和持续黑暗（DD）条件下昼夜节律活动、神经肌肉及神经认知表现的性别和基因型特异性差异，随后检测了昼夜节律紊乱（CD）对这些参数的影响。雌性GHR-野生型（fGHR-WT）小鼠较雌性GHR-敲除（fGHR-KO）小鼠表现出更高的总体总活动量、增强的昼夜节律活动振幅以及更少的碎片化节律。相比之下，fGHR-KO小鼠在相位提前后表现出更快的再同步化，表明昼夜节律适应能力存在差异。fGHR-WT和fGHR-KO小鼠均表现出优于雄性同窝对照的工作记忆，而GHR-KO小鼠较GHR-WT对照表现出增强的神经肌肉表现。CD降低了节律稳定性，并与神经肌肉和认知表现下降相关，尤其在雌性中，同时导致fGHR-KO小鼠在旷场（OF）测试中不动时间增加。总之，这些发现表明老龄GHR-WT和GHR-KO小鼠表现出不同的昼夜节律和行为表型，且昼夜节律组织的破坏加剧了认知和神经肌肉脆弱性。

**衰老生长激素受体敲除小鼠的昼夜节律与行为表型研究解读**
生长激素（GH）对代谢、认知及整体生理功能具有广泛调控作用，其分泌受昼夜节律钟精密调节。GH与生长激素受体（GHR）结合后启动下游信号级联，影响机体生长、代谢及神经功能。在衰老过程中，昼夜节律系统出现活动碎片化、振幅降低等改变，而GH分泌模式亦随年龄发生变化。然而，目前关于GH信号缺失如何影响衰老过程中昼夜节律组织及行为表现的研究十分有限，主要集中于GH信号完整的模型，对GH不敏感状态下昼夜节律与行为表型的变化认知不足。为此，研究人员利用生长激素受体敲除（GHR-KO）小鼠模型——一种GH不敏感（GHI）模型，以循环GH持续升高为特征——系统探究了老龄GHR-KO小鼠在不同光照条件下的昼夜节律活动、神经肌肉及神经认知表现，并进一步评估了昼夜节律紊乱（CD）对这些参数的影响。该研究揭示了性别特异性表型差异，为理解GH信号在衰老过程中的昼夜节律调控作用提供了新见解，论文发表在《GeroScience》。

研究人员主要采用以下关键技术方法：使用红外运动传感器（Honeywell C0100220）记录小鼠自发活动，通过Clocklab软件分析昼夜节律参数（如总活动量、振幅、周期τ、日间变异系数IV、日间稳定性IS、再同步化天数）；采用Y迷宫、旷场（OF）和新物体识别（NOR）测试评估认知功能；利用握力（GS）测试和转棒（Rotarod）测试评估神经肌肉功能与运动协调能力；施加8小时相位提前每3天的慢性“时差”方案诱导昼夜节律紊乱。所有小鼠（17–21月龄）来源于129Ola/BALB/c、C57BL/6J和C3H/J品系杂交的GHR-KO模型，于南伊利诺伊大学医学院动物设施饲养。

**研究结果**
**Characteristics of circadian behavior**：在12:12h光暗（LD）循环下，fGHR-WT小鼠总活动量显著高于fGHR-KO小鼠（F(1,38)=7.698, p=0.0085），且活动振幅受基因型和性别影响（GHR-WT及雌性振幅更高）。活动开始时间仅受性别影响，雌性晚于雄性。
**Female GHR-WT showed a significantly less fragmented daily activity pattern**：在LD条件下，fGHR-WT小鼠的日间变异系数（IV）显著低于fGHR-KO及雄性组，表明活动碎片化程度更低；日间稳定性（IS）仅在fGHR-WT与mGHR-WT间存在差异，前者稳定性更高。持续黑暗（DD）条件下，IV仍表现出基因型差异，fGHR-WT低于fGHR-KO。
**Female GHR-KO exhibit significantly longer τ**：在DD条件下，GHR-KO小鼠的自由运转周期（τ）长于GHR-WT（F(1,37)=5.255, p=0.0277），且Fisher's LSD事后检验显示fGHR-KO的τ显著长于fGHR-WT，雄性组内无差异。
**Female GHR-KO require significantly fewer days to re-entrain compared to female GHR-WT**：经8小时相位提前后，fGHR-KO小鼠的再同步化天数显著少于fGHR-WT（Kruskal-Wallis检验，H(3)=12.98, p=0.0047；Dunn检验p=0.0031），雄性组内无基因型差异。
**GHR-KO mice display enhanced motor performance with sex-specific differences in spatial memory and open field behavior**：握力测试显示GHR-KO小鼠归一化握力显著高于GHR-WT（F(1,74)=56.71, p<0.0001），雌性高于雄性；转棒测试中GHR-KO小鼠跌落潜伏期更长（F(1,74)=22.90, p<0.0001）。Y迷宫自发交替率雌性显著高于雄性（F(1,72)=39.37, p<0.0001），无基因型效应。旷场不动时间显示mGHR-KO显著高于mGHR-WT，且雄性高于雌性，存在基因型×性别交互作用。
**The effects of circadian disruption on activity**：CD后，IV显著增加仅见于fGHR-WT（调整后p=0.0036），而IS在所有四组中均显著下降（所有调整后p<0.0001），表明昼夜节律稳定性普遍受损。
**Female GHR-WT exhibited a significant increase in IV values post-circadian disruption**：如前所述，fGHR-WT在CD后IV显著升高。
**Neuromuscular function in female GHR-WT and GHR-KO mice is significantly impacted by circadian disruption**：CD后，fGHR-WT和fGHR-KO的归一化握力均显著下降（调整后p=0.0005及p<0.0001），而雄性组无显著变化；转棒测试未检测到各组内显著差异。
**Effects of circadian disruption on novel object recognition, Y-maze performance, and open field behavior**：CD后，NOR辨别指数无显著变化；Y迷宫自发交替率在fGHR-WT和fGHR-KO中均显著降低（调整后p=0.0053和p=0.0020），雄性组无变化；旷场不动时间仅在fGHR-KO中显著增加（调整后p=0.0035）。

**总结讨论**
本研究揭示了老龄GHR-WT与GHR-KO小鼠在昼夜节律组织上的显著差异：fGHR-WT小鼠表现出更高的活动振幅、更低的节律碎片化及更强的LD同步性，而fGHR-KO小鼠则具有更长的自由运转周期和更快的相位提前再同步化能力，提示节律巩固与再同步化灵活性可能受GHR信号差异调控。在认知和神经肌肉方面，GHR-KO小鼠（尤其雌性）表现出增强的握力和转棒表现，但空间记忆（Y迷宫）的性别差异独立于基因型。昼夜节律紊乱后，雌性小鼠（尤其fGHR-KO）在神经肌肉和认知功能上表现出更大的脆弱性，包括握力下降、Y迷宫表现降低以及fGHR-KO旷场不动性增加，可能涉及代谢、神经炎症及性二态性机制。尽管GH信号缺失，但老龄GHR-KO小鼠在认知和神经肌肉功能上并未出现全面减退，反而部分表现优于对照，提示慢性升高的GH水平或替代信号通路（如催乳素受体信号）可能发挥补偿作用。

**研究结论**：fGHR-WT小鼠较fGHR-KO小鼠表现出更高的总体活动量、更强的活动振幅以及更少的碎片化昼夜节律。然而，fGHR-KO小鼠在相位提前后表现出更快的再同步化，表明GHR缺失对昼夜节律组织的不同方面产生差异性影响。尽管存在这些节律性差异，fGHR-WT和fGHR-KO雌性小鼠均表现出优于雄性同窝对照的工作记忆表现，而GHR-KO小鼠则表现出较GHR-WT对照更强的神经肌肉表现。在昼夜节律紊乱（CD）后，活动节律变得不稳定，雌性小鼠在神经肌肉和认知表现上表现出更大的脆弱性。CD还与fGHR-KO小鼠在旷场任务中不动时间增加相关。总之，这些发现表明，老龄GHR-WT和GHR-KO小鼠表现出不同的昼夜节律和行为表型，且昼夜节律组织的破坏加剧了认知和神经肌肉的脆弱性。