纳米比亚东北部蜣螂（鞘翅目：金龟子科：蜣螂亚科）的DNA条形码和系统发育分析

《International Journal of Tropical Insect Science》：DNA barcoding and phylogenetic analysis of dung beetles (Coleoptera: Scarabaeidae: Scarabaeinae) in North-Eastern Namibia

　　

分类学检索表因成本效益高且易于获取而被用于蜣螂物种的鉴定。本研究旨在确定纳米比亚东北部蜣螂的DNA条形码和系统发育关系。研究人员使用诱饵陷阱法进行蜣螂采样，并将采集的蜣螂保存于DNA/RNA Shield溶液中。研究人员使用血液和组织Quick-DNA Miniprep Plus试剂盒提取基因组DNA，并使用COI通用引物进行PCR扩增。研究人员使用多重比对ClustalW软件对齐序列FASTA文件，并利用MEGA12软件进行邻接法系统发育分析。共获得62个蜣螂物种的DNA条形码，其中27个测序样本中鉴定出15个物种，匹配度达95–100%，而35个蜣螂序列未在数据库中检索到。邻接系统发育树显示，蜣螂族（Onthophagini）的Onthophagus、Milichus和Caccobius属的9个物种相互分离，并以自展值（>95%）聚为一支。聚类分析将32个物种分为三个主要分支，而两个物种独立于这三个分支之外。本研究首次报道了纳米比亚蜣螂的特异性DNA条形码。DNA条形码和系统发育分析在蜣螂分子鉴定中的应用提供了宝贵且准确的信息，有助于理解其多样性。

**论文解读：纳米比亚东北部蜣螂的DNA条形码与系统发育分析**

**研究背景与问题**
蜣螂（鞘翅目：金龟子科：蜣螂亚科）是一类以粪便为食的腐食性昆虫，在全球生态系统中扮演重要角色，包括改善土壤通气、促进养分循环、二次种子掩埋、寄生虫抑制、生物扰动及蝇类控制等。其多样性与哺乳动物粪便类型、植被、土壤特性及降雨季节性密切相关。然而，基于形态特征的鉴定方法因物种间形态差异微小、不同生命阶段特征多变而面临挑战，尤其是幼虫阶段的鉴定困难。尽管分类学检索表在成虫阶段有效，但仍存在误鉴风险。分子标记，尤其是线粒体DNA（mtDNA）编码的细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因，已被广泛应用于解决此类问题。然而，在纳米比亚，蜣螂的分子鉴定和系统发育研究仍处于空白状态，全球数据库中缺乏该地区蜣螂的DNA条形码和系统发育信息，导致对纳米比亚蜣螂生物地理学、分布和多样性的理解存在显著缺口。此外，环境干扰（如农业扩张和栖息地改造）导致物种多样性丧失，进一步增加了准确鉴定的迫切性。因此，本研究旨在通过DNA条形码和系统发育分析，填补纳米比亚东北部野生动物及野生动物-家畜共存系统中蜣螂的分子鉴定和系统发育关系的知识空白，为全球蜣螂多样性研究提供基础数据。

**研究内容与结论**
研究人员在纳米比亚东北部的Nkasa Rupara国家公园（野生动物系统）和Dzoti保护区（野生动物-家畜系统）采集蜣螂样本，使用诱饵陷阱法，共获得61个样本的线粒体COI基因序列。通过邻接法构建系统发育树，并基于Kimura双参数模型（K2P）计算遗传距离。研究首次报道了纳米比亚蜣螂的DNA条形码，共鉴定出15个物种（匹配度95–100%），另有35条序列未在数据库中匹配，表明该地区蜣螂的分子信息严重不足。系统发育分析将32个物种分为三个主要分支，其中蜣螂族（Onthophagini）的9个物种（Onthophagus、Milichus、Caccobius属）以高自展值（>95%）聚为一支，但该族呈现并系群特征，例如Digitonthophagus gazella、Euonthophagus carbonarius等物种与其余成员分离。此外，研究揭示了多个族（如Gymnopleurini与Scarabaeini）的姐妹群关系，并确认了Pachylomera属作为独立属的分类地位。该研究为纳米比亚蜣螂提供了首个分子数据，强调了COI基因在物种鉴定中的有效性，但指出单一线粒体基因可能不足以解决所有族级深层次关系，需结合其他基因开展进一步研究。论文发表在《International Journal of Tropical Insect Science》。

**主要关键技术方法**
1. **样本采集与保存**：在野生动物和野生动物-家畜两个系统（Nkasa Rupara国家公园与Dzoti保护区）中，使用诱饵陷阱（牛粪诱饵，100 g）收集蜣螂，样本保存于DNA/RNA Shield溶液中，于-20°C冷冻运输。
2. **DNA提取与扩增**：使用血液和组织Quick-DNA Miniprep Plus试剂盒提取基因组DNA，采用COI通用引物（C1-J-2183/LCO1490和TL2-N-3014/HCO2198）进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后送至Inqaba Biotec East Africa测序。
3. **序列分析与系统发育构建**：使用ClustalW软件进行多序列比对，BioEdit v7.2编辑，通过NCBI BLAST比对相似序列；基于Kimura双参数模型（K2P）和1000次自展检验，利用MEGA12软件构建邻接系统发育树，并使用FigTree v1.4.4可视化。

**研究结果**
1. **DNA条形码**：研究人员对比了61个线粒体DNA扩增子，涵盖20个属（如Allogymnopleurus、Caccobius、Catharsius等），提交至BOLD Systems。经比对和修剪后，序列长度为786 bp。27条序列在NCBI GenBank中匹配，鉴定出15个物种（分布14个属），匹配度95–100%。另有35条序列未在数据库中检索到，需依赖形态学特征鉴定。
2. **系统发育分析**：邻接系统发育树显示37个物种分为三个主要分支（含35个物种），另有两个物种（NP37 Phalops flavocinctus和NP21 Oniticellus formosus）独立于分支之外。分支1包含蜣螂族（Onthophagini，9个物种，自展值>95%）、蜣螂族（Onitini，2个物种，>99%）、蜣螂族（Sisyphini）和蜣螂族（Oniticellini）。分支2包含Gymnopleurini、Scarabaeini等4个族的物种（>95%），其中Chalconotus convexus分离。分支3仅包含Catharsius aegeus和C. tricornutus（>99%）。
3. **族级关系**：Gymnopleurini与Scarabaeini呈姐妹群关系；Onitini与Onthophagini、Oniticellini关系密切；Onthophagini呈并系群，其中Digitonthophagus gazella等物种分离，且Onthophagus属高度多系（polyphyletic），Caccobius nigritulus和Milichus apicalis嵌套于其中。Coprini中Catharsius属呈现同塑性（homoplasy），不共享共同祖先。

**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次报道了纳米比亚蜣螂的DNA条形码，但大量序列（约35条）未在数据库中匹配，表明该地区蜣螂分子信息匮乏，可能与撒哈拉以南非洲地区蜣螂的全球代表不足有关。研究发现了多个新物种的首次COI序列（如Copris elphenor、Heliocopris japetus、Onthophagus flavolimbatus等），并确认了Pachylomera属作为独立属的分类地位（与Scarabaeus属呈姐妹群）。COI基因能有效鉴定纳米比亚蜣螂，但单一基因可能无法解决所有族级深层次关系，建议结合其他基因进行综合研究。结论部分翻译如下：
**结论**：纳米比亚野生动物和野生动物-家畜系统中蜣螂的DNA条形码和系统发育分析首次提供了该地区蜣螂的序列数据，为全球金龟子科数据库做出贡献。COI基因被推荐为蜣螂物种DNA条形码和系统发育分析的有效标记；然而，使用其他基因进行种群遗传学综合研究至关重要。同时，单一的线粒体COI基因序列可能不足以解决纳米比亚分布的不同蜣螂族之间的深层次关系，因此应开展进一步研究。最后，本研究结果与其他生态区的研究结果可共同用于推进对全球蜣螂关系的更好理解。