可成药性CRBN互作组的蛋白质组范围鉴定

《Nature Biotechnology》：Proteome-wide identification of the druggable CRBN interactome

　　

分子胶降解剂（MGD）如泊马度胺（pomalidomide）通过其底物受体cereblon（CRBN）诱导cullin-RING E3连接酶4（CRL4）对非天然底物的降解。为探索CRBN的可编程性，研究人员测试了已报道的CRBN–MGD底物是否属于潜隐CRBN互作因子网络，即一类能够在MGD诱导下与CRBN结合但未被检测到降解的蛋白质。研究人员利用高通量蛋白互补 assay（GluePCA）测量CRBN与锌指（ZF）之间的MGD诱导相互作用，鉴定出约210个与CRBN–泊马度胺结合的锌指，其中顶部结合者已被专用MGD降解。为在蛋白质组范围绘制潜隐CRBN–MGD互作并定义可接近的CRBN互作空间，研究人员将人工智能衍生的蛋白表面查询（MaSIF-mimicry）与GluePCA结合。该流程鉴定出6个已知和43个新型CRBN–泊马度胺结合子，包括正交验证的命中靶点。研究人员发现这些结合子为MGD开发提供了优先起点。该聚焦结合的流程有望适用于其他MGD–E3连接酶系统，潜在扩展这一新兴药物类别的范围。

研究背景与问题提出

分子胶降解剂（MGD）是一类通过E3泛素连接酶诱导靶蛋白降解的小分子，代表药物如lenalidomide（来那度胺）已在多发性骨髓瘤中获批，其通过CRL4^CRBN E3泛素连接酶靶向降解Ikaros和Aiolos等C₂H₂锌指（ZF）转录因子。尽管已有越来越多ZF及非ZF蛋白（如GSPT1、VAV1、CK1α）被鉴定为CRBN–MGD底物，且多数含保守的甘氨酸β-发夹α转角（G-loop），但细胞降解中表现出的表观特异性与MGD广泛潜在可达性之间存在矛盾。核心科学问题是：哪些蛋白或折叠是潜在的CRBN–MGD靶点，以及如何实现特异性。传统MGD发现依赖表型筛选、降解报告系统、质谱互作组学和计算预测，但缺乏可扩展、整合的实验-计算流程来全蛋白质组绘制可接近的CRBN–MGD互作空间。该研究发表于《Nature Biotechnology》，旨在建立此类流程。

主要关键技术方法

研究人员构建了高通量蛋白互补assay（GluePCA），将小鼠二氢叶酸还原酶（DHFR）拆分为DH与FR片段分别融合CRBN与候选蛋白，以MGD依赖的DHFR重构活性指示结合；结合基于MaSIF框架的表面模拟工具（MaSIF-mimicry），利用AlphaFold2（AF2）预测的人类蛋白质组结构库进行界面相似性检索；并行开展深度突变扫描（DMS）、冷冻电镜（cryo-EM）结构解析、哺乳动物细胞降解报告与NanoBiT招募assay，以及针对新型靶点的聚焦化合物库筛选。候选蛋白经截短为含degron的86残基“bonsai”亚结构域以适配文库构建。

研究结果

GluePCA measures compound-dependent ZF binding to CRBN

研究人员通过单克隆GluePCA确认Ikaros ZF2等阳性对照在泊马度胺存在下依赖生长，浓度动态范围与体外IC₅₀一致。池化高通量筛选8363个C₂H₂ ZF，鉴定出201个剂量依赖性结合子，覆盖已知降解ZF（Ikaros、Aiolos、SALL4、WIZ等）及新命中（ZNF852、ZNF341、REST双ZF等），并在293T细胞中正交验证降解。双ZF文库（5293个）进一步显示附属ZF（aZF）可增强主ZF（mZF）结合与降解。

CRBN–pomalidomide recognizes a three-consecutive-ZF degron

通过对124个双ZF结合子构建89918个单点突变的DMS文库，研究人员确定mZF主导结合，aZF可正向或负向调节。cryo-EM解析SALL4^ZF123与Ikaros^ZF23结合DDB1^ΔB~CRBN~泊马度胺复合物（3.5 ?），发现mZF两侧aZF可形成至多连续三个ZF的degron，SALL4 mZF2后另有一α-helix增强结合约1.4倍，说明aZF以非保守新形态（neomorphic）模式参与。

The molecular basis of specificity for CRBN-based degraders

以Helios特异性降解剂ALV2进行双ZF GluePCA，研究人员发现ALV2选择性富集Helios/Eos并显著降低其余ZF信号。cryo-EM解析Helios^ZF123~DDB1^ΔB~CRBN~ALV2（3.6 ?）显示ALV2同时稳定mZF2（H141）并与aZF1残基（I122、N125、S133、V129）直接作用，S133A/V129A突变消除结合；对比SALL4~泊马度胺结构，ALV2通过aZF空间排斥其他ZF，实现“稳定靶标+去稳定非靶标”的双重特异性机制。

Proteome-wide prediction of CRBN targets using surface mimicry

研究人员以MaSIF-mimicry查询已知底物（Ikaros ZF2、ZNF692 ZF4等）界面，在AF2人类蛋白质组结构库中检索，恢复已知ZF底物且相似性评分优于序列/结构比对。扩展至全蛋白质组获7480个非ZF候选，截短为1959个bonsai亚域进行GluePCA，回收mTOR、CHD7、HNRNPD等已知底物及43个新型结合域（如CHD8、SPART、CKAP5、RNF39、TDRD6），其中SPART为螺旋G-loop，CKAP5为非G-loop（丙氨酸替代甘氨酸），G/N或A/N突变取消结合，NanoBiT正交验证一致。

GluePCA hits are privileged entry points for novel MG discovery

研究人员选取新型靶RNF39 RING域，以960个免疫调节药物类似物库（CRBN-960）进行NanoBiT筛选，0.85%化合物结合增强超泊马度胺2倍，Z5000181945和Z4999952733分别增强5倍，剂量响应饱和于1 μM；Z5000181945诱导RNF39 RING域降解且被NAE抑制剂MLN4924挽救，证明GluePCA命中可直接转化为降解剂起点。

讨论与结论翻译

研究人员讨论指出，CRL4^CRBN是可拓展降解系统，研究建立MaSIF-mimicry与GluePCA耦合的可扩展流程，在ZF家族中发现逾210个剂量依赖性CRBN–MGD结合子，并将空间扩至全蛋白质组，获43个新型非ZF结合构造，包含β-发夹G-loop、螺旋G-loop及非G-loop模式。机制上ZF degron可由连续三ZF加附属元件构成，aZF以新形态方式调谐亲和与降解，ALV2类MGD利用aZF直接接触实现选择性。该结合中心互作组揭示广泛潜隐CRBN互作，为未来MGD优化提供起点，流程可移植至其他E3–MGD系统。结论：研究人员呈现一种整合工作流，将MaSIF-mimicry与GluePCA耦合以定义给定靶标的互作组，应用于CRBN–泊马度胺可提供通用策略以探索并扩展其他MGD系统的结合潜能，预期该工作流可完全移植至其他E3连接酶MGD复合物。