c-Myc的光邻近标记揭示SLK是一种癌症特异性共调节因子

《Nature Chemical Biology》：Photoproximity labeling of c-Myc reveals SLK as a cancer-specific co-regulator

　　

转录因子（Transcription factors, TFs）是理想的治疗靶点，因为它们的失调驱动细胞状态改变。然而，许多疾病相关的TFs是无序的且缺乏经典结合口袋，这阻碍了直接小分子抑制。间接靶向调节TF功能的效应分子是一种有前景但尚未充分探索的替代方案。研究人员在此报告了一种策略，利用背景依赖的μMap光邻近标记（photoproximity labeling）来捕获癌症特异性蛋白-蛋白相互作用。通过基于intein的方法在生化完整的细胞核中连接催化剂，研究人员在健康和癌性前列腺细胞中捕获了独特的c-Myc相互作用组，并从中挖掘可药物化的脆弱点。研究人员鉴定出STE20样激酶（STE20-like kinase, SLK）是一种癌症特异性相互作用因子，它稳定c-Myc，驱动上皮形态，并对肿瘤发生至关重要。机制上，SLK在丝氨酸329（serine 329）磷酸化c-Myc，拮抗GSK3β依赖的磷酸化降解信号（phosphodegron phosphorylation）。这种相互作用与促进长SLK亚型核定位的剪接变化相关。患者数据将这种亚型与多种肿瘤类型中的c-Myc靶基因表达联系起来；该相互作用在不同组织中得到验证。

**论文解读：c-Myc的光邻近标记揭示SLK作为癌症特异性共调节因子**

**研究背景与问题**
转录因子（Transcription factors, TFs）是癌症生物学中最具吸引力但最难靶向的靶点之一。c-Myc作为关键的致癌转录因子，在超过40%的癌症中失调，控制着数千个与生长相关的基因表达。然而，c-Myc蛋白无序且缺乏典型结合口袋，直接小分子抑制极为困难。间接靶向调节c-Myc功能的效应蛋白已被证明是治疗c-Myc驱动癌症的有效方法。以往研究通过免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, co-IP）和BioID邻近标记等方法鉴定c-Myc相互作用组，但这些方法标记半径较大（BioID约100 nm），倾向于标记转录活性染色质区域而非直接调控因子，且从未在匹配的癌细胞系中同时应用以鉴定特定癌症表型或亚型特有的相互作用因子。因此，需要一种高空间分辨率的邻近标记方法，在疾病特异性背景下捕获c-Myc的直接相互作用伙伴，从而发现可药物化的癌症特异性共调节因子。本研究发表于《Nature Chemical Biology》。

**主要技术方法**
研究人员采用μMap光邻近标记技术，该技术利用超快split-intein系统将铱光催化剂（iridium photocatalyst）无痕连接至c-Myc蛋白，在生化完整细胞核中进行1分钟蓝光照射，使diazirine-biotin探针形成卡宾（carbene），交联半径约4 nm的邻近蛋白，通过质谱（data-independent acquisition label-free quantitation, DIA-LFQ）鉴定相互作用组。此外，结合CRISPR-Cas9敲除（SLK-KO）、体外激酶实验、ChIP-seq、RNA-seq、免疫沉淀、免疫荧光、流式细胞术等方法，并在前列腺细胞系（健康WPMY-1、AR阴性癌PC-3、AR阳性癌LNCaP）及多肿瘤类型细胞系（胶质母细胞瘤DBTRG-05MG、胰腺导管腺癌Panc 08.13和PACADD-161、非小细胞肺癌CAL-12T和NCI-H1573）中进行验证，患者数据来自TCGA TARGET GTEX研究。

**研究结果**
**Nuclear μMap captures c-Myc interactomes**
研究人员在HEK293T细胞中验证了c-Myc-CfaN构建体的功能活性，确认其维持转录活性。μMap光邻近标记结合无标记化学蛋白质组学，鉴定出157个显著富集的c-Myc相互作用蛋白，包括已知共调节因子MAX、EP400、TRRAP、EPC1，且显著富集Ada-two-A-containing（ATAC）和NuA4/TIP60组蛋白乙酰转移酶复合物。与co-IP和BioID数据集相比，μMap提供了更受限的相互作用组，反映其纳米级标记半径（~4 nm）带来的高空间特异性。JQ-1处理实验进一步证实该方法可检测染色质结合c-Myc相互作用组的细微变化。

**c-Myc interactome in prostate cell lines**
比较健康前列腺细胞（WPMY-1）、AR阴性前列腺癌（PC-3）和AR阳性前列腺癌（LNCaP）的c-Myc相互作用组，发现常见共调节蛋白（如MAX），但各细胞系在蛋白降解相关蛋白（蛋白酶体、E3连接酶）富集程度上存在显著差异，与c-Myc半衰期相关。通过交叉分析富集蛋白与DepMap RNA干扰（RNAi）筛库数据，在PC-3细胞中唯一鉴定出STE20样激酶（STE20-like kinase, SLK）作为可药物化的癌症特异性c-Myc相互作用因子。与BioID对比，μMap在PC-3细胞中鉴定出更少的蛋白（519 vs 1563），但SLK仅在μMap中显著富集。

**SLK interacts with c-Myc only in PC-3 cells**
SLK在三个细胞系中蛋白水平相似，但仅在PC-3细胞中观察到核内SLK显著增加。免疫共沉淀（co-IP）证实c-Myc与SLK在PC-3而非LNCaP或WPMY-1中相互作用，该相互作用不依赖DNA支架，且依赖于c-Myc的MB0和MBIV结构域。使用diazirine足迹法鉴定SLK的多个内在无序区域（IDRa–e）和C端卷曲螺旋结构域为c-Myc结合位点。

**SLK controls c-Myc stability in PC-3**
CRISPR敲除SLK（SLK-KO）使PC-3细胞中c-Myc蛋白水平降至野生型的约20%，而mRNA水平仅下降1.5倍，放线菌酮追踪实验显示c-Myc半衰期从138分钟降至60分钟，表明SLK主要通过蛋白水平稳定c-Myc。体外激酶实验发现SLK在丝氨酸329（Ser329）磷酸化c-Myc，该位点突变S329A缩短半衰期，而S329D延长半衰期。SLK磷酸化c-Myc可拮抗GSK3β对T58磷酸化降解信号的磷酸化，且SLK与GSK3β竞争结合c-Myc（IC50约20–30 nM）。邻近连接实验（PLA）显示SLK-KO后c-Myc与GSK3β相互作用显著增加。

**Impact of SLK on cellular phenotype**
SLK-KO在PC-3细胞中导致c-Myc靶基因表达显著降低，外源c-Myc回补可恢复。ChIP-seq显示c-Myc和RNA Pol II在靶基因上的占据基本不变，表明转录变化源于c-Myc蛋白水平下降而非染色质重分布。SLK-KO导致细胞增殖减慢（倍增时间从31 h增至54 h）、S期细胞减少、G2期积累、伤口愈合能力下降，且这些表型在c-Myc回补后恢复。SLK-KO在WPMY-1细胞中影响最小。异种移植模型显示SLK-KO完全抑制肿瘤形成。蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析显示SLK-KO导致上皮标志物丢失、自噬和干扰素响应蛋白上调、细胞周期相关磷酸化位点富集减少，以及ATM激酶活性增加，提示DNA损伤响应激活。

**SLK splicing is unique in PC-3 cells**
SLK存在两种剪接亚型：长型（SLK-L，包含外显子13，编码核定位序列）和短型（SLK-S，外显子13跳读）。仅PC-3细胞表达SLK-L，其与ESRP1/2高表达和RBFOX2低表达相关。TCGA/GTEx数据分析显示，在前列腺癌样本中SLK-L占约75%，而在正常前列腺中SLK-S占主导；在所有肿瘤类型中SLK-L均占优势，且SLK-L表达与c-Myc靶基因表达正相关。

**Generality of the c-Myc–SLK interaction**
在胶质母细胞瘤、胰腺导管腺癌和非小细胞肺癌细胞系中，SLK依赖性细胞系（DepMap分析）均表现出核SLK定位和c-Myc–SLK免疫共沉淀阳性，而SLK非依赖性细胞系（NCI-H1573）则无，验证了该相互作用的普遍性。

**讨论与结论**
本研究开发的光催化邻近标记策略（μMap）能够发现c-Myc处可药物化的癌症特异性相互作用。在AR阴性前列腺癌模型PC-3细胞中，鉴定出SLK的长剪接亚型（SLK-L）定位于细胞核，与c-Myc相互作用并通过磷酸化Ser329拮抗GSK3β介导的T58磷酸化降解，从而稳定c-Myc蛋白。SLK基因敲除抑制c-Myc靶基因表达、增殖、迁移，并在异种移植模型中完全消除肿瘤形成，且这些效应在健康细胞中最小。该相互作用的癌症选择性源于剪接调控因子（ESRP1/2高表达，RBFOX2低表达）导致的SLK-L亚型核定位，而非总蛋白水平变化。μMap的~4 nm标记半径相比BioID的~100 nm半径提供了更高的空间特异性，使SLK得以被鉴定。患者数据分析表明SLK-L在多种癌症中占主导并与c-Myc靶基因表达相关，提示该调控轴具有广泛适用性。研究结论：SLK核定位可作为预测生物标志物，SLK抑制或降解可能是可行的治疗策略；μMap为绘制转录依赖性图谱和解析恶性肿瘤蛋白网络提供了通用框架。