《npj Breast Cancer》：Genome-wide DNA methylation profiling of triple-negative breast cancer uncovers epigenetic biomarkers of tumor identity and the immune microenvironment
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DNA甲基化失调是肿瘤生物学的一个本质特征，影响癌症形成与发病机制。由于数据高维性、噪声及不同细胞类型的混合，批量癌症标本的DNA甲基化分析具有挑战性。研究人员通过在三阴性乳腺癌（TNBC）模型中识别高度相关的CpG基团（称为CpG cassettes），考察
DNA甲基化失调是肿瘤生物学的一个本质特征，影响癌症形成与发病机制。由于数据高维性、噪声及不同细胞类型的混合，批量癌症标本的DNA甲基化分析具有挑战性。研究人员通过在三阴性乳腺癌（TNBC）模型中识别高度相关的CpG基团（称为CpG cassettes），考察批量肿瘤DNA甲基化数据的方差结构，从而表征癌症中的甲基化动态。该方法识别出与不同内禀肿瘤过程及通路、基因失活以及肿瘤免疫微环境（TIME）组成共发生的甲基化模式。框架还显示出存在看似与肿瘤生物学无关的高方差DNA甲基化，可通过染色质可及性过滤排除。综上，本研究勾勒出分析批量肿瘤DNA甲基化数据的综合路径，结合肿瘤纯度调整、功能性CpG过滤、按CpG语境分层以及识别高相关CpG模块，以增强肿瘤内禀DNA甲基化模式及对塑造表观遗传肿瘤进化过程的理解。
研究背景与立项依据
DNA甲基化（DNA methylation）作为表观遗传调控的核心机制，通过在Cytosine-phosphate-Guanine（CpG）二核苷酸的胞嘧啶上加合甲基，参与转录调控、基因印记、X染色体失活及重复元件抑制。在癌症中，甲基化失调驱动基因组修复、免疫逃逸与治疗应答等过程。批量肿瘤组织DNA甲基化谱常由高密度微阵列获得，但高维数据受分析噪声、肿瘤异质性及非恶性细胞（具细胞类型特异性甲基化特征）混合的干扰，单CpG的β值估计产生偏差。传统方差过滤保留高变CpG，却可能保留与生物学无关的高方差位点，且受正常细胞比例等外源混杂影响；肿瘤纯度校正虽可缓解，但仍未解决CpG基因组语境（启动子、近端、远端）与染色质状态带来的功能异质性。三阴性乳腺癌（TNBC）占乳腺肿瘤10–20%，缺乏ER/PR/HER2表达，高度异质、基因组不稳定，既往研究表明Basal/non-Basal是TNBC甲基化景观的两大吸引子状态，但批量数据如何解构以同时反映肿瘤内禀过程与免疫微环境（TIME）仍不清楚。该研究以TNBC为模型，旨在解构批量甲基化数据方差结构，识别共变CpG模块（CpG cassette），厘清生物信号与噪声。
主要技术方法与队列
研究人员采用瑞典SCAN-B发现队列235例原发TNBC（741145个CpG位点，M值）与136例SCAN-B验证队列；外部验证使用TCGA-BRCA 645例各分子亚型乳腺肿瘤。甲基化平台为Illumina Infinium（450K/EPIC）。关键方法包括：肿瘤纯度校正（调整β值）、按CpG语境（启动子/近端/远端）分层、基于加权基因相关网络分析（WGCNA）软阈值β=7识别CpG cassette、染色质可及性过滤（重叠ATAC-seq峰，Corces等）、MethylCIBERSORT反卷积免疫细胞分数、PAM50与Lehmann分型、差异表达与GO富集、Boruta随机森林选特征、空间转录组（Nanostring CosMx）及scRNA-seq正常乳腺与TNBC细胞系验证。
研究结果
CpG cassettes in tumor purity-adjusted TNBC DNA methylation data
在纯度校正后M值上运行WGCNA（β=7），较未校正数据获得更清晰的模块间模式与样本间一致性；纯度校正后MethylCIBERSORT估算肿瘤分数上升。按CpG语境分别聚类显示语境本身不被方差过滤或纯度校正捕获，但模块组成显著偏离总体分布（如cassette 1富启动子/近端，cassette 2–4富远端）。随机子采样100例重复20次，远端cassette结构稳定；验证队列中除distal cassette 106外均中度至高度保留（Zsummary），证明cassette框架稳健可重现。
CpG cassettes reflect major biological classes in TNBC
七大语境内cassette中，promoter cassette 1（5616 CpG）、proximal cassette 1（5322）、proximal 2（989）、proximal 4（445）、distal cassette 3（7398）与PAM50 Basal/non-Basal分类调整兰德指数（ARI）>0.55。将ARI>0.55的19770 CpG分层聚类可区分Basal与non-Basal。promoter cassette 1富集发育过程GO，其甲基化二分聚类驱动LDHB、MUCL1、FCN2等表达差异，LDHB在non-Basal因启动子高甲基化而低表达；proximal cassette 1富集发育/神经发育GO，SPINK8等表达与近端CpG甲基化负相关，仅在non-Basal表达。
Chromatin accessibility distinguishes biologically relevant variation in distal CpGs
distal cassette 1（22901 CpG）呈梯度高方差，增强子重叠约23%、重复序列约28%、TFBS重叠极低、CpG密度稀疏；其PC1与Basal/non-Basal、HRD、Lehmann亚型、纯度、TILs均无关联，差异甲基化分析极少选中，属非信息噪声。方差过滤无法剔除该cassette（即便未校正纯度）；而ATAC-seq峰重叠过滤可去除cassette 1/4/5/7等低功能重叠模块，保留cassette 2/3中约50% CpG，新模块与原功能模块对应。该噪声模式在TCGA全乳腺癌各PAM50亚型中同样存在，cassette 2/3仍对齐Basal/non-Basal。
Specific promoter CpG cassettes correlate with TIME status in TNBC
启动子cassette 34（19 CpG）全为BRCA1关联CpG，其PC1与HRD表型及焦磷酸测序BRCA1甲基化一致。对61个启动子cassette PC1与TILs Kendall相关，17个cassette二分聚类后TILs显著变化；Boruta选出12个，其中promoter cassette 9（46 CpG）相关性最高，关联基因GBP4、RSAD2、CD274、OAS2、ZBP1等16个，GO富集于先天/抗病毒免疫。SCAN-B验证队列中cassette 9高甲基化组免疫metagene秩分显著降低；TCGA-TNBC中低甲基化伴免疫浸润升高。
Features of a promoter CpG cassette associated with TIME status in TNBC
聚焦多CpG映射且经Bonferroni校正显著的5基因（GBP4、OAS2、CARD16、ZBP1、SAMD9L）：各自CpG呈高/低甲基化双态，与基因FPKM表达显著相关（发现队列与SCAN-B/TCGA验证一致）。高甲基化肿瘤TILs与PDL1-CPS更低（免疫冷）；MethylCIBERSORT与免疫组化均示低甲基化组B细胞/细胞毒T细胞浸润更高。5基因高甲基化共现于non-Basal、LAR及Mesenchymal Lehmann亚型；累积高甲基化与免疫metagene降低、基质metagene及成纤维细胞分数升高相关。
Characterization of the promoter CpG cassette associated with TIME status across breast cancer subtypes
TCGA-BRCA中Basal亚型的TILs最高，Luminal A/Normal-like最低。cassette 9在全体乳腺癌中虽二元性减弱，但低甲基化仍伴高浸润。GBP4/OAS2/ZBP1/CARD16（SAMD9L因450K缺覆盖排除）各基因高甲基化在non-Basal占比更高，共低甲基化样本TILs最高。在Basal/HER2-enriched/Luminal B内低甲基化伴高TILs，Luminal A/Normal-like无差异。
Methylation and expression patterns of promoter cassette 9-associated genes in normal breast cells
正常乳腺批量数据（Hair等96例、Jenkins等113例）示OAS2/GBP4/SAMD9L倾向低甲基化，CARD16/ZBP1 β≈0.5（细胞混合）；流式分选血细胞中所有基因CpG低甲基化。scRNA-seq（Reed等）示5基因在上皮（CARD16/GBP4）、免疫（CARD16树突/NK、GBP4 NK、SAMD9L树突/巨噬、ZBP1 NK/浆细胞）、基质（GBP4/CARD16广布）异质表达，总体呈免疫偏向低甲基化–可表达模式。
Tumor-intrinsic expression of promoter cassette 9-associated genes
34株TNBC细胞系bulk RNA示SAMD9L/CARD16/OAS2/GBP4内禀表达，ZBP1近乎无声；8株匹配EPIC甲基化与RNA-seq示启动子低甲基化伴高表达。19株TNBC scRNA-seq证实瘤内异质表达。8例原发TNBC scRNA-seq示肿瘤细胞中5基因共表达趋势与免疫热相关。65例Discovery队列TMA经Nanostring CosMx空间转录组聚焦OAS2：肿瘤细胞OAS2表达与cassette 9中OAS2启动子β值Spearman=-0.48，低甲基化肿瘤瘤细胞表达比例与强度均显著更高，确立肿瘤内禀甲基化–表达轴。
讨论与结论翻译
研究人员通过识别高相关CpG模块（CpG cassette）解构TNBC批量甲基化方差结构，发现模块既捕捉Basal/non-Basal内禀状态、BRCA1失活等肿瘤过程，也捕捉与TIME相关的启动子模块（cassette 9），同时暴露distal cassette 1/4/5/7等无生物学锚点的高方差噪声——此类噪声无法被方差过滤剔除，但可被ATAC-seq染色质可及性过滤隔离。纯度校正提升肿瘤内禀CpG相关度。cassette 9中GBP4/OAS2/CARD16/ZBP1/SAMD9L属先天免疫/抗病毒通路，其启动子高甲基化富集于non-Basal、LAR及Mesenchymal TNBC，与免疫冷TIME、低TILs及PDL1-CPS相关；细胞系、scRNA-seq与CosMx空间证据支持该甲基化–表达耦合为肿瘤内禀属性而非基质污染。结论：该框架将肿瘤纯度调整、CpG语境分层、功能过滤与模块识别整合，可增强批量肿瘤甲基化数据的生物学可解释性，并提供TNBC表观遗传免疫逃逸的候选生物标志物。论文发表于《npj Breast Cancer》。
