从探针到前药：免疫蛋白酶体活性作为疾病选择性治疗药物的触发器

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：From probe to prodrug: immunoproteasome activity as a trigger for disease-selective therapeutics

　　

开发能够利用细胞内在机制选择性地在患病细胞中释放有毒化合物，同时保持健康细胞不受影响的新策略是一项具有挑战性的任务。一种已建立的方法涉及肿瘤细胞上的抗原识别，通过可裂解连接子将细胞毒性化合物连接到抗体上，从而实现前药（prodrug）的靶向递送。然而，该策略依赖于高度表达的表面标志物的存在，以便开发抗体，这限制了其对表达这些标志物的癌症的适用性。一种新的方法可能依赖于疾病特异性表达的细胞内酶，该酶可以更广泛地靶向，从而在临床上扩展前药的治疗潜力。在这里，研究人员证明，免疫蛋白酶体（immunoproteasome，iCP）是标准蛋白酶体（standard proteasome，sCP）的一种亚型，在炎症条件下上调，具有作为前药释放酶的潜力。研究人员将高毒性且广泛使用的治疗性货物MMAE（monomethyl auristatin E）偶联到免疫蛋白酶体选择性肽上，并证明其在癌细胞中以低nM到pM浓度选择性释放，而健康细胞保持存活。研究人员还首次建立了转化验证，即在小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）中，使用免疫蛋白酶体前药在体内导致肿瘤体积显著减小，且无明显毒性。研究人员预计这种方法将广泛适用，因为免疫蛋白酶体在多种癌症中上调，且不需要抗体识别即可有效。

**研究背景与问题**
药物发现领域长期面临的核心挑战是如何特异性地杀伤患病细胞，同时避免对健康组织的毒性。现有策略，如抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate，ADC），依赖于肿瘤细胞表面高表达的特异性抗原，通过抗体介导的内吞和溶酶体裂解释放毒性载荷。然而，许多癌症（尤其是缺乏可靶向表面标志物的类型）难以通过此方法治疗，且ADC的疗效受限于抗原异质性、肿瘤渗透性差及制造复杂性。此外，传统蛋白酶体抑制策略虽在血液肿瘤中有效，但脱靶毒性限制了其应用。免疫蛋白酶体（immunoproteasome，iCP）作为标准蛋白酶体（standard proteasome，sCP）的亚型，在炎症因子（如IFN-γ）刺激下显著上调，并在多种癌症（包括小细胞肺癌）中高表达，但其内源性活性尚未被充分利用于前药释放。本研究旨在开发一种不依赖抗体识别、基于细胞内iCP酶活性的前药策略，以实现对癌细胞的精准杀伤，同时保护健康细胞。
**研究内容与结论**
研究人员将高毒性治疗药物MMAE（monomethyl auristatin E）通过自消融连接子（para-aminobenzyl alcohol，PABC）偶联至iCP选择性四肽序列Ala-Thr-Met-Trp（ATMW），构建前药m-ATMW-PABC-MMAE。通过生化实验、细胞毒性分析、体内异种移植模型及人源免疫类器官评估，证明该前药在iCP高表达的癌细胞中特异性释放MMAE，诱导凋亡和坏死，而在健康细胞中保持惰性。在体内小细胞肺癌模型中，前药显著减小肿瘤体积，且未引起系统性毒性，同时保留B细胞、CD4⁺ T细胞及调节性T细胞（Treg）等免疫细胞群。该研究首次验证了iCP作为前药释放酶在体内的治疗潜力，为难以靶向的癌症提供了一种通用的、无需抗体的治疗策略。论文发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
**关键技术与方法**
1. **前药设计与合成**：采用固相肽合成（SPPS）构建m-ATMW肽，偶联自消融连接子PABC，再与MMAE连接，经HPLC纯化获得终产物。
2. **生化裂解分析**：使用纯化的人iCP或sCP孵育前药，通过LCMS检测游离MMAE释放量，评估选择性。
3. **细胞活性检测**：利用CellTiter-Glo^?发光法测定细胞活力；使用TBZ-1活性探针监测iCP（β5i）活性；通过Annexin V/PI染色和流式细胞术分析凋亡。
4. **体内模型**：采用免疫活性小鼠（orthotopic SCLC模型）和NOD scid gamma（NSG）小鼠（皮下NCI-H446异种移植模型），通过尾静脉或眼眶后静脉注射给药，监测肿瘤体积、体重及血清生化指标。
5. **人源免疫类器官**：从11个独立供体获取扁桃体组织，制备免疫类器官，经活减毒流感疫苗（LAIV）刺激，评估前药对B细胞、CD4⁺ T细胞亚群的影响，使用高维光谱流式分析。
6. **组织学分析**：H&E染色评估坏死，免疫组化检测活化caspase-3以评估凋亡。
**研究结果**
**Developing an immunoproteasome prodrug strategy**
通过LCMS分析，研究人员发现iCP能有效裂解m-ATMW-PABC-MMAE，释放游离MMAE，而sCP的裂解效率降低约4倍；对照前药m-ATMA-PABC-MMAE（Trp→Ala）裂解显著减少。小鼠微粒体和人血清稳定性实验显示，前药在1小时后保持约80%完整。
**The immunoproteasome prodrug is active in diseased cells but inactive in healthy cells**
在iCP高表达的Ramos细胞中，前药展现出与游离MMAE相当的低nM IC₅₀值；而在iCP低表达的HEK-293T细胞中，前药在最高浓度（96小时）下无毒性。对照前药（ATMA或Ac-MMAE）或预先用iCP抑制剂ONX-0914处理后，Ramos细胞毒性消失。Annexin V/PI染色证实前药通过凋亡途径诱导细胞死亡。在可诱导iCP的A549细胞中，IFN-γ预处理使前药IC₅₀降低约10倍，而MMAE毒性不变，证明iCP依赖性释放。
**Small-cell lung cancer as a model to assess preclinical prodrug translation**
NCI-60筛选显示前药对白血病等iCP高表达癌症敏感，而对肾癌等低表达癌症不敏感，与iCP mRNA水平相关。在SCLC NCI-H446细胞中，前药和MMAE均显示低nM IC₅₀，对照前药活性弱。共聚焦显微镜显示前药导致微管完全抑制，与MMAE机制一致。siRNA敲低β5i后，前药毒性降低10倍，进一步确认iCP介导的激活。
**An immunoproteasome prodrug can reduce the toxicity of MMAE in vivo**
在免疫活性小鼠原位SCLC模型中，0.4 mg/kg MMAE组在4天内出现严重体重下降和毒性（仅1只存活），而前药组（0.83 mg/kg，等效MMAE剂量）无体重损失，所有小鼠存活，且生物发光成像显示肿瘤显著减小。
**Small cell lung cancer tumor burden reduced after treatment with immunoproteasome prodrug**
在NSG小鼠皮下NCI-H446模型中，前药低剂量（0.83 mg/kg）和高剂量（1.66 mg/kg）均显著减小肿瘤体积，高剂量组接近完全消退。肿瘤组织LCMS检测到游离MMAE，确认原位激活。H&E染色显示前药组坏死增加，免疫组化显示活化caspase-3阳性细胞增多。血清生化分析未见明显毒性。
**Immunoproteasome prodrug preserves B- and CD4 T-cell populations in human-derived organoids**
在11个供体的人扁桃体免疫类器官中，10 μM前药处理未显著影响总细胞活力，保留B细胞、CD4⁺ T细胞、浆母细胞和调节性T细胞（Treg）频率，而游离MMAE导致浆母细胞减少、Treg抑制。
**讨论与结论**
讨论部分指出，传统靶向蛋白酶体抑制的策略虽有效，但未能充分利用其复杂功能。本研究的iCP前药策略利用iCP活性而非抑制，避免影响其天然免疫功能，为炎症性疾病和癌症提供新治疗思路。NCI-60数据表明该方法在多种iCP上调的癌症中具有广泛适用性，尤其适用于ADC无效或不可用的适应症（如三阴性乳腺癌）。体内实验首次证明iCP前药能有效减小肿瘤且无系统性毒性，且避免了抗体依赖的递送复杂性。
**研究结论翻译**：这提供了第一个证明，即免疫蛋白酶体（iCP）靶向前药可以在癌症的临床前模型中有效。虽然本报告聚焦于小细胞肺癌（SCLC），但研究人员的NCI-60数据及相应的iCP mRNA水平表明，该方法在多种癌症中具有广泛适用性，特别是在抗体-药物偶联物（ADC）通常无效的癌症中，如三阴性乳腺癌。研究人员预计，这种蛋白酶响应策略将激发针对疾病背景下蛋白酶体亚型的新药物发现工作。此外，由于该方法不依赖抗体偶联进行递送或激活，它提供了一种易于处理的替代方案，适用于抗原导向ADC无效、不可用或受限于肿瘤渗透性差、高度异质性或制造复杂性的适应症。