KRAS突变非小细胞肺癌药物重定位候选物的综合计算与临床前评价

《Scientific Reports》：Integrated computational and preclinical evaluation of drug repurposing candidates for KRAS-mutant non-small cell lung cancer

　　

KRAS突变，特别是KRAS G12C，在非小细胞肺癌（NSCLC）中由于抑制剂疗效有限和快速耐药，构成了重大治疗挑战。药物重定位提供了一种省时且经济有效的策略，以识别靶向KRAS驱动信号通路的替代治疗选择。研究人员采用基于结构的药物重定位方法，筛选靶向MAPK信号通路关键调节因子的FDA批准化合物，并通过计算模拟其与KRAS G12C switch-II口袋的潜在结合。计算分析包括虚拟筛选、分子对接和分子动力学模拟，用于评估结合亲和力、稳定性和潜在的蛋白质-配体相互作用。先导候选物随后通过体外功能测定、鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）和体内化学诱导肺癌模型进行验证。计算分析确定尼洛替尼（nilotinib）和利培酮（risperidone）为MAPK通路靶点的高亲和力候选物。功能测定证实，尼洛替尼显著降低NSCLC细胞活力、集落形成和血管生成，同时抑制细胞迁移并诱导凋亡。在体内，尼洛替尼在化学诱导的小鼠肺癌中显著降低肿瘤负荷并调节免疫和炎症特征。这些发现支持尼洛替尼作为KRAS突变NSCLC的有前景的治疗候选药物。需要进一步开展靶点结合测定、通路验证实验和基因定义的KRAS G12C驱动模型研究，以确定其精确的作用机制。

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，2022年占所有癌症死亡的18.7%，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的80%–85%，其中KRAS突变见于约30%的腺癌，KRAS G12C是最常见的热点突变。MAPK信号通路（包含受体酪氨酸激酶RTK、RAS、RAF、MEK和ERK）是驱动增殖、转移和免疫逃逸的核心网络。尽管靶向KRAS G12C的抑制剂（sotorasib和adagrasib）已获批，但继发性KRAS突变、RTK再激活和旁路信号导致的获得性耐药仍显著限制其临床获益。传统药物发现成本高昂且耗时，仅约10%的候选药物能获得监管批准。药物重定位利用已有药物的安全性和药理学数据，为加速发现KRAS突变NSCLC的替代治疗策略提供了可行途径。为此，研究人员采用基于结构的药物重定位管道，从FDA批准药物库中筛选可能靶向KRAS G12C及MAPK通路关键节点（EGFR、BRAF、MEK、ERK、SHP2）的候选化合物，并通过体外、离体和体内模型进行系统验证。该研究发表于《Scientific Reports》。

研究人员从RCSB蛋白质数据银行（PDB）获取六个MAPK通路靶蛋白（EGFR、KRAS G12C、BRAF、MEK、ERK、SHP2）的三维结构，使用Schr?dinger Suite进行蛋白制备。FDA批准药物库（Selleckchem，共3183个药物）经LigPrep生成3984个配体结构。采用Glide HTVS和标准精度（SP）对接进行虚拟筛选，CovDock评估与KRAS G12C Cys12的共价结合潜力。Desmond模块执行分子动力学（MD）模拟，对六个靶点复合物各运行100 ns，对KRAS G12C-尼洛替尼共价复合物延伸至300 ns。体外实验使用NCI-H23细胞（KRAS G12C突变，由Adichunchanagiri Institute of Medical Sciences提供），包括MTT细胞活力、克隆形成、划痕迁移、流式细胞周期和Annexin V凋亡检测。离体实验采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型。体内实验使用BALB/c小鼠（购自KCC Bio-labs），以苯并[a]芘（B[a]P）诱导肺癌，尼洛替尼口服给药50和75 mg/kg，评估血清肿瘤标志物、组织病理及免疫细胞亚群。

HTVS分析：以Glide HTVS筛选FDA药物库，根据负对接分数（阈值＞?7 kcal/mol）和结合互补性过滤，每个靶点选出前三个化合物进行SP docking。

Standard precision molecular docking：SP对接显示C1（尼洛替尼）在大多数靶点（尤其是KRAS、ERK和SHP2）表现出强结合亲和力，优于或等同于各靶点标准抑制剂；C2（利培酮）对BRAF和MEK结合良好；C3较弱。综合评估后C1被选为最有前景的候选物。

CovDock analysis：CovDock分析显示三种化合物均可能通过“双键亲核加成”机制与KRAS G12C的Cys12形成共价相互作用。C1的CovDock分数为?9.01 kcal/mol，接近参考共价抑制剂sotorasib（?9.4 kcal/mol），并与His95、Tyr96、Gln99等关键残基发生相互作用。

MD simulation analysis：100 ns RMSD轨迹显示C1与所有六个MAPK靶点的复合物整体稳定；KRAS G12C-C1复合物比C2和C3更稳定。扩展的300 ns共价复合物模拟显示初始波动后轨迹平稳，与Cys12的氢键维持约100%模拟时间，并观察到与Gln99、Val9、Lys16、Thr58等残基的稳定接触。

Assessment of cell viability using MTT colorimetric assay：MTT实验显示尼洛替尼和利培酮均剂量依赖性地降低NCI-H23细胞活力，尼洛替尼IC₅₀为31.51 μM，显著低于利培酮的81.78 μM，表明其细胞毒效力更强，因此被确定为先导化合物继续研究。

Clonogenic cell survival analysis：克隆形成实验表明，尼洛替尼处理后的平均集落数（233±7）显著低于未处理对照组（557±12），且低于顺铂（351±10）和利培酮（396±6），证实其具有持久的抗增殖作用。

Cell migration by wound healing assay：划痕愈合实验显示，尼洛替尼在24小时时伤口愈合率为30.82%，低于顺铂的40.86%，表明对细胞迁移的抑制更显著；48小时时两者接近（45.07% vs 47.92%），提示其能持续抑制迁移。

Cell cycle study using FACS：流式细胞周期分析显示，尼洛替尼处理使G2/M期细胞比例从对照的22.1%增至33.69%，G0/G1期比例下降，提示细胞阻滞于G2/M检查点。

Annexin V-FITC apoptosis assay：Annexin V-FITC/PI流式凋亡检测表明，尼洛替尼诱导早期凋亡（51.63%）和晚期凋亡（21.8%），总凋亡比例约73.4%，高于顺铂的63.99%，证实其强效促凋亡活性。

Evaluation of anti-angiogenic activity using the CAM assay：离体CAM实验表明，尼洛替尼处理显著降低血管交接点数量和平均血管长度，主要破坏血管网络的复杂性和分支，而血管面积百分比与顺铂相当。

In vivo BALB/c analysis：B[a]P诱导的肺癌小鼠中，尼洛替尼剂量依赖性地降低相对肺重，75 mg/kg组效果更佳；血清肿瘤标志物（ADA、AHH、LDH）显著下降；组织病理显示肿瘤包块缩小、炎症浸润减少，以75 mg/kg组最为明显。

Flow cytometry (FACS) analysis of immune cell populations in NSCLC：FACS分析显示，B[a]P诱导的荷瘤小鼠中CD3⁺CD8⁺ T细胞显著升高，尼洛替尼处理后这些细胞群体明显下降，表明其调节适应性免疫反应。

Dendritic cells and monocytes：B[a]P组CX3CR1⁺CD11c⁺树突细胞和Ly6c⁺MHC II⁺单核/巨噬细胞显著增多，尼洛替尼处理后均显著减少，提示其减轻肿瘤相关免疫炎症。

M2 macrophage aggregation：肿瘤小鼠中M2型巨噬细胞（CD206⁺F4/80⁺）比例明显升高，尼洛替尼处理后显著降低，尤其在高剂量组，提示其可能重塑肿瘤微环境中的免疫抑制状态。

讨论部分指出，尼洛替尼原为BCR-ABL/c-Kit/PDGFR抑制剂，用于慢性髓系白血病（CML），本研究发现其对MAPK通路六个靶点均表现出强预测结合和稳定复合物构象。体外和体内实验证实其通过抑制增殖、迁移、克隆形成、诱导凋亡和细胞周期阻滞，并抑制血管生成、调节免疫细胞亚群，发挥多轴抗肿瘤活性。与其他酪氨酸激酶抑制剂（如伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、索拉非尼）相比，尼洛替尼具有更广泛的MAPK通路靶点结合特征。然而，尼洛替尼并非特异性设计用于KRAS G12C，其IC₅₀高于已获批的KRAS G12C抑制剂；共价结合模式仅为计算预测，尚无生化实验证实；体内模型也非KRAS G12C驱动。未来需通过生化结合检测、KRAS G12C特异性体内模型、药代动力学表征及联合sotorasib或免疫检查点抑制剂的研究，进一步明确其机制和转化价值。

本研究确立了基于结构的药物重定位作为加速KRAS突变非小细胞肺癌治疗发现的可行策略。通过集成的计算管道和实验验证，尼洛替尼成为一种有效的多靶点候选药物，对KRAS G12C结合位点和关键MAPK通路调节因子具有强预测亲和力。体外测定证实了其在KRAS G12C突变NCI-H23细胞中抑制增殖、抑制克隆形成存活、减少集体细胞迁移、诱导凋亡和细胞周期阻滞积累的能力。鸡胚绒毛尿囊膜实验进一步验证了尼洛替尼的抗血管生成活性，B[a]P诱导的肺癌模型中的体内研究显示肿瘤相关标志物显著降低和肿瘤微环境中的免疫细胞调节。这些发现强调尼洛替尼在其CML获批适应症之外的转化潜力，支持其作为KRAS驱动肺癌的再定位药物进一步评估。关键后续步骤包括KRAS G12C结合的生化确认、在KRAS G12C特异性体内模型中的验证、治疗剂量的药代动力学表征以及与已批准KRAS G12C抑制剂或免疫检查点阻断剂联合策略的评估。