《Nature Communications》：Genome-wide CRISPR screening identifies cellular factors controlling nonviral genome editing efficiency
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为了系统性地绘制限制非病毒基因组编辑、影响摄取和细胞内运输的细胞因子，研究人员开发了一个全基因组CRISPR筛选平台，将19,114个基因的扰动与人类细胞中的编辑结果联系起来。研究人员鉴定出六个递送的负调控因子，其缺失在多种载荷、位点和细胞类型中使编辑效率提高
为了系统性地绘制限制非病毒基因组编辑、影响摄取和细胞内运输的细胞因子，研究人员开发了一个全基因组CRISPR筛选平台，将19,114个基因的扰动与人类细胞中的编辑结果联系起来。研究人员鉴定出六个递送的负调控因子，其缺失在多种载荷、位点和细胞类型中使编辑效率提高多达六倍。研究人员在两种不同的人类模型中测试了前两个因子GJB2和BET1L：纠正KCNJ13中的致病性腺嘌呤碱基突变和引入GABAA受体基因中的胞嘧啶碱基突变。任一因子的缺失通过可能对递送的影响使碱基编辑结果提高6倍。在患者来源的视网膜通道病模型中，任一基因的敲低使脂质纳米颗粒（LNP）碱基编辑效率提高超过3.5倍。这使得在部分编辑细胞中实现了Kir7.1离子通道的功能恢复，突出了细胞屏障作为增强基因治疗效力的可操作靶点。
**研究背景与问题**
基因组编辑已成为一种变革性治疗手段，但非病毒递送载体（如脂质纳米颗粒（LNP））在体内，特别是感觉神经、有丝分裂后组织（如视网膜）中的编辑效率远低于离体编辑。主要瓶颈在于细胞摄取和胞内运输：超过99%的内化货物无法成功逃逸内体进入细胞质，而基因组编辑器需要进入细胞核才能发挥作用。此前研究多聚焦于细胞核内的DNA修复机制，缺乏对“递送-编辑”全链条（从摄取、运输到核输入和DNA修复）的系统性理解。因此，开发无偏见的筛选方法以揭示限制非病毒递送的细胞屏障，对于拓展基因组编辑的临床应用至关重要。
**研究内容与结论**
研究人员开发了一个全基因组CRISPR敲除筛选平台，以HEK293细胞为模型，将19,114个基因的扰动与非病毒递送SpCas9核糖核蛋白（RNP）的编辑结果直接关联。通过in-cis设计（在同一条DNA扩增子上同时读取sgRNA身份和编辑状态），筛选出26个敲除后提高编辑效率的候选基因。经阵列验证和功能分析，确认六个高置信度负调控因子（BET1L、GJB2、MS4A13、RBM44、SLCO1C1、ZNF584），其缺失在多种递送载体（脂质体转染、LNP）和核酸形式（mRNA、蛋白）下均能提高编辑效率。电穿孔实验表明，绕过细胞膜后这些基因的增强效应消失，提示其作用机制主要在递送阶段（如摄取或胞内运输）。多光谱成像流式细胞术进一步证实，BET1L、MS4A13和GJB2敲除后Cas9-GFP的核积累增加。在两种人类疾病模型（KCNJ13 W53X突变和GABAA受体Q217X突变）中，GJB2或BET1L敲除使腺嘌呤或胞嘧啶碱基编辑效率提高5-6倍。在LCA16（Leber先天性黑矇16型）患者来源的iPSC-RPE（视网膜色素上皮细胞）中，敲低BET1L或GJB2使LNP递送的ABE8e碱基编辑校正效率分别提高3.6倍和8倍（最高达46.6%），且部分编辑细胞恢复了Kir7.1离子通道的功能性电流。该论文发表在《Nature Communications》。
**主要技术方法**
1. **全基因组CRISPR敲除筛选平台**：使用Brunello文库（靶向19,114个基因，每基因4条sgRNA），通过慢病毒转导HEK293细胞，构建含SpCas9和sgRNA的文库。利用脂质体2000递送SpCas9 RNP靶向整合的Brunello盒，通过下一代测序（NGS）同时读取sgRNA身份和编辑结果（indel），实现in-cis筛选。
2. **基于流式细胞术的EGFP报告验证**：在稳定表达EGFP的HEK293-GFP细胞中，通过LNP递送Cas9 mRNA和EGFP sgRNA，以EGFP荧光消失作为编辑效率的替代读数，验证候选基因敲除的效果。
3. **多光谱成像流式细胞术**：使用ImageStream X Mark II，递送Cas9-GFP蛋白后6小时，定量分析核内Cas9-GFP的积累，以评估核转运效率。
4. **脂质纳米颗粒（LNP）制备与递送**：采用微流控方法制备LNP（SM-102或GDLP配方），封装编码碱基编辑器（ABE8e、BE4max）的mRNA和sgRNA，递送至细胞进行碱基编辑。
5. **自动膜片钳电生理学**：使用QPatch II系统记录单个细胞的Kir7.1通道电流，通过Rb
+诱导的电流幅度变化评估功能恢复。
**研究结果**
**1. Genome-wide CRISPR screening identifies regulators of nonviral genome editing**
通过全基因组CRISPR筛选，在HEK293细胞中鉴定出26个敲除后增加SpCas9 RNP编辑效率的候选基因。这些基因富集于膜运输、胞内运输等通路，与以往仅发现核内DNA修复因子的筛选不同。
**2. Validation identifies six high-confidence negative regulators of nonviral editing**
在HEK293细胞中生成26个单基因敲除（KO）细胞系，分别通过脂质体转染RNP靶向NRL基因和LNP递送Cas9 mRNA/EGFP sgRNA进行验证，最终确定BET1L、GJB2、MS4A13、RBM44、SLCO1C1、ZNF584为高置信度负调控因子，其敲除可使EGFP功能蛋白表达降低多达10倍。
**3. Top candidates regulate editor delivery upstream of DNA repair**
当通过电穿孔直接递送Cas9 RNP进入细胞质和核质时，所有候选基因敲除株的编辑效率与野生型（WT）无显著差异，表明这些基因主要在递送阶段（而非DNA修复）发挥作用。多光谱成像流式细胞术显示，BET1L、MS4A13和GJB2敲除后，Cas9-GFP在核内的积累增加约1.5倍，进一步支持其调控递送/胞内运输。
**4. GJB2 and BET1L depletion potentiates base editing in human cell models**
在HEK293 KCNJ13 W53X突变模型（腺嘌呤碱基编辑ABE8e）和HEK293 GABAA受体模型（胞嘧啶碱基编辑BE4max）中，GJB2或BET1L敲除分别使碱基编辑效率提高6.7倍和5倍，且indel频率极低（<0.3%），证明该增强效应适用于不同碱基编辑器和基因组位点。
**5. Functional rescue of an LCA16 patient-derived retinal model**
在患者来源的iPSC-RPE细胞（携带KCNJ13 W53X突变）中，通过慢病毒介导的BET1L或GJB2敲低，联合LNP递送ABE8e，使校正效率分别提高3.6倍（至20.9%）和8倍（至46.6%）。免疫细胞化学和自动膜片钳电生理学证实，部分编辑细胞恢复Kir7.1蛋白的顶膜定位及Rb
+诱导的离子通道功能，其中GJB2敲低组的功能恢复具有统计学显著性。
**讨论与结论**
讨论指出，本研究建立了高分辨率全基因组筛选平台，同时评测了递送、运输和核修复的细胞决定因素，突破了以往仅关注核内DNA修复的局限。电穿孔实验排除了这些基因主要通过改变DNA修复动力学或Cas9内在活性影响编辑的假设，支持其作用于递送环节。在患者来源RPE细胞中实现的功能恢复证明了临床相关性，但完全恢复WT细胞的表型仍需优化。GJB2和BET1L的敲除也增强了碱基编辑（不依赖DNA双链断裂），进一步支持其机制主要涉及递送而非DNA损伤修复。然而，GJB2对听力发育至关重要，因此永久性全身敲除不可行，未来治疗策略应转向瞬时调控（如共递送siRNA、CRISPRi或小分子抑制剂）。本研究的发现将递送优化从仅关注载体设计扩展到调节宿主细胞本身。
**研究结论**：本研究的全基因组筛选识别了许多特异性限制非病毒基因组编辑效力的细胞屏障。通过在不同背景下扰动这些屏障，研究人员排除了筛选假象，并定义了一个以细胞内可用性为中心的合理作用机制。这些发现将递送优化的范式从仅关注载体（例如，载体或LNP设计）转变为调节宿主细胞本身。最终，这些内源性屏障的瞬时调控代表了一个有前景的新前沿，用于增强在难治组织中的基因药物效力。
