新型11H-茚并[1,2-b]喹喔啉衍生物的合成及其体外和计算机模拟抗癌活性研究

《Scientific Reports》：Synthesis of novel 11H-indeno[1,2-b]quinoxaline derivatives and their in vitro and in silico insights into anticancer activities

　　

在本工作中，研究人员合理设计并合成了一系列新型11H-茚并[1,2-b]喹喔啉衍生物，旨在探索其潜在抗癌活性。通过红外光谱（IR）、¹H NMR、¹³C NMR、³¹P NMR、质谱（MS）和单晶X射线衍射分析对新型化合物进行了表征。化合物8a和8b对MCF-7细胞系的抗癌活性显示出良好的效果，IC₅₀值分别为18.9和33.0?μg/mL。另一方面，化合物12和14对HCT116细胞系的抗肿瘤活性显示出令人鼓舞的结果，IC₅₀值分别为47.3和21.4?μg/mL。此外，研究人员采用计算机模拟方法，包括ADME、BOILED-Egg和生物活性雷达，评估了合成杂合物的口服生物利用度。进行了分子对接，以确定衍生物与PDB：6vj3和6GUE蛋白的结合姿态和相互作用。

**研究背景与问题**
含氮杂环化合物（如茚并喹喔啉）在药物研发中具有重要地位，已发现其具有抗菌、抗癌、c-Jun N端激酶（JNK）抑制、α-葡萄糖苷酶抑制等多种生物活性。腙类及酰腙化合物（结构含–CO–NH–N=基团）同样表现出抗癌、抗菌、抗炎等药理活性。此外，“神奇甲基”策略和有机磷化合物（OPCs）在药物化学中应用广泛。然而，现有茚并喹喔啉衍生物的抗癌谱尚不完善，且不同取代基对其活性的影响需进一步探索。为此，本文研究人员设计并合成了一系列新型11H-茚并[1,2-b]喹喔啉衍生物，系统评估其体外抗癌活性，并通过计算机模拟揭示其作用机制。该研究发表于《Scientific Reports》。

**研究内容与结论**
研究人员合成了10种茚并喹喔啉衍生物（化合物3、4、8a、8b、10E、11、12、13、14、15），通过红外光谱、核磁共振（¹H、¹³C、³¹P NMR）、质谱及单晶X射线衍射确认结构。体外细胞毒性实验（MTT法）显示：磷酸酯衍生物8a（二乙基磷酸酯）和8b（二甲基磷酸酯）对MCF-7乳腺癌细胞系活性最强，IC₅₀分别为18.9和33.0 μg/mL；吡唑螺环化合物12和14对HCT116结肠癌细胞系活性最优，IC₅₀分别为47.3和21.4 μg/mL。基因表达分析表明，化合物8a处理MCF-7细胞后，抗凋亡基因Bcl-2表达下调、促凋亡基因BAX和肿瘤抑制基因P53表达上调。细胞周期分析显示，8a可将MCF-7细胞阻滞于G0/G1期。分子对接表明，8a与乳腺癌相关蛋白（PDB:6vj3）结合能最高（-9.4 kcal/mol），14与结肠癌相关蛋白（PDB:6GUE）结合能最高（-8.8 kcal/mol）。ADME预测显示所有化合物符合Lipinski五规则，口服生物利用度良好。构效关系（SAR）分析指出，取代基类型（如乙氧基优于甲氧基、吡唑环上甲基优于乙基）显著影响活性。

**主要技术方法**
1. **化学合成与结构表征**：采用乙酰化、甲基化、与亚磷酸酯反应、与醛酮缩合等方法合成目标化合物，通过IR、多核NMR（¹H、¹³C、³¹P）、质谱及单晶X射线衍射确证结构。
2. **体外细胞毒性实验**：MTT法检测化合物对人乳腺癌MCF-7和人结肠癌HCT116细胞系的增殖抑制（细胞来源：埃及国家研究中心生物分析细胞培养实验室），计算IC₅₀。
3. **基因表达分析**：提取MCF-7细胞总RNA，逆转录后使用qRT-PCR检测Bcl-2、BAX、P53基因的mRNA表达水平。
4. **细胞周期分析**：碘化丙啶（PI）染色后流式细胞术检测细胞周期分布。
5. **分子对接**：使用AutoDock Vina软件，将化合物对接到乳腺癌蛋白（PDB:6vj3）和结肠癌蛋白（PDB:6GUE）的活性位点，评估结合能及相互作用。
6. **ADME预测**：通过SwissADME在线服务器计算化合物的理化性质、口服生物利用度（生物活性雷达、BOILED-Egg模型）及药代动力学参数。

**研究结果**
**Chemistry**：通过乙酰化、甲基化、与亚磷酸酯反应、与醛酮缩合等步骤成功合成了目标化合物，并经光谱和单晶衍射确认结构。
**Cytotoxicity assay**：MTT法显示，8a和8b对MCF-7细胞活性最强（IC₅₀ 18.9和33.0 μg/mL）；12和14对HCT116细胞活性最强（IC₅₀ 47.3和21.4 μg/mL）；10E、11、13对两种细胞均无活性。
**Expression of BCl2, BAX and P53 in MCF-7 cell lines**：qRT-PCR显示，8a处理MCF-7细胞后，抗凋亡基因Bcl-2表达显著下调（至68%），促凋亡基因BAX上调（420%），肿瘤抑制基因P53上调（532%），与阳性对照多柔比星趋势一致。
**Cell cycle analysis**：流式细胞术显示，8a处理MCF-7细胞后G0/G1期比例从75.15%升至81.34%，提示细胞周期阻滞于G0/G1期。
**Molecular docking**：分子对接表明，8a与乳腺癌蛋白6vj3结合能最高（-9.4 kcal/mol），形成氢键（ASN62、THR199）；14与结肠癌蛋白6GUE结合能最高（-8.8 kcal/mol），形成氢键（GLU12、TYR15）。重对接RMSD分别为1.4 ?和0.77 ?，验证了方法可靠性。
**SwissADME analysis**：化合物8a、8b、12、14均符合Lipinski五规则，口服生物利用度良好；8b、12、14可透过血脑屏障（BBB），而8a不可；8a、8b、12为P-糖蛋白底物，14不是。
**Structure activity relationship (SAR) studies**：含二乙基磷酸酯的8a活性优于二甲酯的8b；含吡唑环的12和14对HCT116活性优于MCF-7；甲基取代的14优于乙基取代的15。电子供体基团增强活性，空间位阻影响抑制效果。

**讨论与结论**
研究结果表明，新型茚并喹喔啉衍生物的抗癌活性与取代基类型密切相关。磷酸酯基团（尤其是乙氧基）显著增强对MCF-7细胞的毒性，而吡唑螺环结构有利于HCT116细胞抑制。基因表达和细胞周期分析揭示了8a通过上调BAX/P53、下调Bcl-2诱导凋亡，并阻滞于G0/G1期。分子对接和ADME预测为候选药物的进一步优化提供了理论依据。
**结论翻译**：总之，研究人员合成了一系列新的茚并喹喔啉衍生物，对其进行了表征并评估了抗癌活性。这10种化合物在MCF-7和HCT-116细胞系中表现出显著的增殖抑制。具体而言，磷酸酯衍生物8a和8b对MCF-7细胞显示出最强的细胞毒性，而化合物12和14对HCT-116细胞活性最强。此外，部分化合物表现出中等或无细胞毒性。对目标化合物进行了构效关系（SAR）研究，阐明茚并喹喔啉母核上取代基的类型影响其抗肿瘤活性。分子对接分析显示，8a对乳腺癌蛋白（6vj3）的结合能（-9.4 kcal/mol）高于其他合成杂合物，而化合物14对结肠癌蛋白（6GUE）的结合能（-8.8 kcal/mol）更高。