何首乌叶抗氧化成分表征及基于二维液相色谱-电化学检测与超高效液相色谱-Orbitrap串联质谱的产地区分

《Antioxidants》：Characterization of Antioxidant Constituents and Geographical Differentiation of Polygonum multiflorum Thunb. Leaves Using 2D-LC-ECD and UHPLC-Orbitrap-MS/MS

　　

本研究建立一种基于离线二维液相色谱-电化学检测（2D-LC-ECD）联合超高效液相色谱-Orbitrap串联质谱（UHPLC-Orbitrap-MS/MS）的活性导向分析方法，用于全面表征何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）叶（PML）的抗氧化成分，并筛选不同产地样品中的差异化合物。研究人员利用2D-LC-ECD结合体外自由基清除实验筛选抗氧化成分，通过UHPLC-Orbitrap-MS/MS进行结构鉴定，并对31批样品中19种主要成分进行化学计量学分析与定量测定。从PML中共鉴定出43种潜在抗氧化化合物，包括11种酚酸、29种黄酮、2种二苯乙烯苷和1种氨基酸；酚酸及其衍生物与黄酮被确定为何首乌叶抗氧化活性的主要贡献者。层次聚类分析（HCA）与主成分分析（PCA）均按产地将样品分为四类；正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型（R2X = 0.933，R2Y = 0.941，Q2 = 0.846）筛选出10个关键标记物（VIP > 1）。定量结果显示何首乌苯乙酮苷（polygoacetophenoside）在PML中含量最高。综上，2D-LC-ECD联合LC-Orbitrap-MS/MS策略证实酚酸与黄酮是PML抗氧化能力的核心物质基。

研究背景与立项依据

何首乌（Polygonum multiflorum Thunb.）为传统补益类中药，其块根抗氧化、抗衰老及调脂作用已有较多药理报道，核心活性物质包括二苯乙烯苷、蒽醌、酚酸与黄酮。相比之下，何首乌叶（PML）在民间作代茶饮，现代研究提示其提取物具有抗氧化、抗炎、调脂、降糖及神经保护等多重活性，化学组成以黄酮、酚类和多糖为主，二苯乙烯苷与蒽醌含量极低，但针对PML抗氧化活性成分的系统性解析长期不足。天然植物化学成分复杂，常规一维液相色谱（1D-LC）峰容量有限，结构相近的酚酸与黄酮易共洗脱；同时中药材产地生态条件显著调控次生代谢物合成，导致质量差异。为此，研究人员开展本研究，旨在借助高分辨活性导向分离鉴定技术，明确PML抗氧化物质基础并揭示产地化学分化规律，为何首乌叶作为天然抗氧化剂开发提供科学支撑。论文发表于《Antioxidants》。

主要关键技术方法

研究人员采集贵州省内四大传统产区（青龙、从江、都匀、湄潭）31批新鲜PML样品，经40℃烘干、粉碎过60目筛后备用。核心方法为离线反相×反相二维液相色谱-电化学检测（RP×RP 2D-LC-ECD）：第一维采用Phenyl-Hexyl柱以甲醇-0.1%甲酸水梯度洗脱并分段收集100个馏分，第二维采用HSS T3柱以乙腈-柠檬酸盐缓冲液分离，电化学检测电位600 mV；同步以DPPH与ABTS体外自由基清除实验计算Trolox当量（TE）验证馏分活性。结构鉴定依托UHPLC-Orbitrap-MS/MS（HESI负离子模式，全扫描MS/dd-MS²，分辨率60000/15000）。对31批样品另建UHPLC-Orbitrap-MS/MS多成分析平台，结合HCA、PCA与OPLS-DA化学计量学及19种主要成分定量分析完成产地溯源与标志物筛选。

研究结果

3.1 基于2D-LC-ECD的PML抗氧化化合物分离与鉴定

3.1.1 2D-LC-ECD分离：RP×RP模式两维选择性正交，峰1–43在电化学电极表面呈强还原响应，较1D-LC分辨率显著提升。

3.1.2 第一维馏分抗氧化评价：前30 min亲水性馏分ABTS与DPPH清除力显著强于后段；ECD峰面积与ABTS（r=0.9559）、DPPH（r=0.9336）清除当量呈显著正相关，证实峰1、8、16对应主要抗氧化物。

3.1.3 UHPLC-Orbitrap-MS/MS鉴定：自43个响应峰鉴定出43种潜在抗氧化物，含酚酸及其衍生物11种（没食子酸与咖啡酸系为主）、黄酮29种（黄烷醇、槲皮素、芹菜素、山奈酚系等）、二苯乙烯苷2种及色氨酸1种；酚酸靠多位酚羟基供氢/单电子转移稳定自由基，黄酮靠B环邻二酚与C环3-OH螯合金属并清除自由基，共同构成PML抗氧化核心物质基础。

3.2 不同产地PML抗氧化成分比较

3.2.1 HCA：基于43成分标准化峰面积欧氏距离平均联结，31批样品在距离30聚为四大类，每类严格对应单一产地，从江组内同质最高、青龙组变异较大。

3.2.2 PCA：无监督降维PC1解释37.7%、PC2解释21.1%，累计58.8%；样品落于95%置信椭圆内无离群，四产地沿PC1/PC2轴空间分离，从江沿PC1负轴完全独立，湄潭组内聚集最紧。

3.2.3 OPLS-DA：有监督模型R²X=0.933、R²Y=0.941、Q²=0.846，200次置换检验Q²截距?0.661无过拟合；VIP>1筛选10标记物——槲皮苷、何首乌苯乙酮苷、儿茶素、异牡荆素、甲基4,6-二-O-没食子酰-β-D-吡喃葡萄糖苷、表儿茶素没食子酸酯、芹菜素-O-葡萄糖苷、异槲皮苷、1-咖啡酰-β-D-葡萄糖、槲皮素-3-O-新橙皮糖苷。

3.3 不同产地PML主要抗氧化成分定量分析

3.3.1 方法学验证：19成分线性R²>0.9900，LOD 0.01–0.57 μg/mL，LOQ 0.03–1.9 μg/mL，日内RSD 1.41%–2.23%，回收率93.04%–105.29%，基质效应92.05%–109.98%。

3.3.2 31批定量：何首乌苯乙酮苷平均3121.23 μg/g为最高，都匀S9达4856.79 μg/g、青龙S1最低2041.87 μg/g；儿茶素、槲皮苷、金丝桃苷平均分别为1798.10、366.79、340.69 μg/g；青龙S29槲皮苷907.94 μg/g最高，从江S4金丝桃苷966.86 μg/g最高，青龙S27异牡荆素1194.85 μg/g突出；湄潭样品表儿茶素没食子酸酯与没食子酸均值偏高。

讨论与结论翻译

讨论指出，相较既往1D-LC-UV或1D-LC-MS轮廓分析，本研究离线2D-LC-ECD与UHPLC-Orbitrap-MS/MS联用兼具活性导向高灵敏筛查、RP×RP高峰容量解卷积及高分辨碎片确证三重优势，所筛10标记物可作抗氧化品质评价与地理溯源潜指标。结论部分表明：研究人员通过2D-LC-ECD耦合UHPLC-Orbitrap-MS/MS活性导向策略，系统阐明PML抗氧化组分及产地变异特征；体外自由基清除证实酚酸与黄酮为主导活性源，多变量统计获10关键生物标记物，定量揭示产地显著调控次生代谢积累；上述发现不仅厘清PML抗氧化物质基，更为其质量控制、溯源及何首乌叶等药用植物理性开发奠定科学基础。