橙皮素负载PLGA纳米颗粒改善顺铂诱导的大鼠氧化应激和睾丸功能障碍：与NRF2/HO-1、NF-κB和ACSL4/GPX4/SLC7A11信号调节的关联

《Antioxidants》：Hesperetin-Loaded PLGA Nanoparticles Ameliorate Cisplatin-Induced Oxidative Stress and Testicular Dysfunction in Rats: Association with NRF2/HO-1, NF-κB, and ACSL4/GPX4/SLC7A11 Signaling Modulation

　　

背景：顺铂（cisplatin，CIS）是一种广泛使用的化疗药物，其性腺毒性效应主要由氧化应激和炎症驱动，对男性生殖健康构成重大威胁。本研究评估了橙皮素（hesperetin，HES）和橙皮素负载聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米颗粒（hesperetin-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) nanoparticles，HES-PLGA-NPs）是否能够保护成年雄性Sprague Dawley大鼠免受顺铂诱导的睾丸功能障碍。方法：将60只大鼠随机分为6组：对照组、HES组、HES-PLGA-NPs组、顺铂（CIS）组、CIS+HES组和CIS+HES-PLGA-NPs组。CIS（7.5 mg/kg/周，腹腔注射）连续腹腔给药4周，同时HES和纳米HES（50 mg/kg/天，口服）口服给药。检测了生殖激素、睾丸重量、精子参数、氧化应激和抗氧化标志物、NRF2/HO-1和NF-κB信号、凋亡指标、铁死亡相关标志物、组织病理学以及GPX4/ACSL4免疫表达。结果：CIS引起显著的生殖功能障碍，包括睾酮、促卵泡激素（FSH）和黄体生成素（LH）降低、睾丸重量减轻、精子质量受损。这些变化与严重的氧化和亚硝化应激（↑ MDA、NO、8-OHdG）、抗氧化防御耗竭（↓ SOD、CAT、GSH）、NRF2/HO-1降低、NF-κB活性和促炎细胞因子升高、凋亡相关变化（↑ Bax、caspase-3；↓ Bcl-2）以及铁死亡相关改变（↑ Fe²⁺、TFR1、脂质ROS、ACSL4、4-HNE；↓ GPX4、SLC7A11）相关。HES和HES-PLGA-NPs均与这些改变的显著改善相关，但纳米制剂显示出更明显的保护作用，将多个氧化和铁死亡相关标志物正常化至接近对照水平，并更有效地保护了生精小管结构和精子发生。结论：HES-PLGA-NPs与对顺铂诱导的睾丸氧化、炎症、凋亡和铁死亡相关损伤的多机制保护相关，可能代表一种有前景的纳米抗氧化剂候选物，值得进一步研究以保护化疗期间男性生殖功能。

**论文解读：橙皮素负载PLGA纳米颗粒缓解顺铂诱导的睾丸氧化应激与功能障碍——基于NRF2/HO-1、NF-κB及ACSL4/GPX4/SLC7A11信号调节的研究**

**一、研究背景与问题**

顺铂（cisplatin，CIS）作为临床广泛应用的化疗药物，对多种恶性肿瘤具有显著疗效，但其剂量限制性毒性严重制约了其应用，尤其对男性生殖系统造成显著损伤。睾丸组织因生精细胞快速增殖且对氧化还原失衡高度敏感，成为顺铂毒性作用的主要靶器官之一。顺铂诱导的睾丸毒性主要表现为生精小管退化、精子发生障碍、精子质量下降以及生殖激素（睾酮、促卵泡激素FSH、黄体生成素LH）紊乱。从机制上看，这些损伤与过度氧化应激、持续性炎症、线粒体功能障碍及内在凋亡信号激活密切相关。近年来，铁死亡（ferroptosis）作为一种新型调节性细胞死亡方式，被证实参与顺铂诱导的睾丸损伤。铁死亡特征为铁依赖性脂质过氧化、关键抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抑制、Fe²⁺及脂质活性氧（lipid ROS）积累。此外，酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）表达上调、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）下调进一步加剧该过程。

橙皮素（hesperetin，HES）是一种柑橘类黄酮，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等药理活性，可通过直接清除自由基、抑制脂质过氧化及调节氧化还原敏感信号通路来保护睾丸。然而，HES的水溶性差、口服生物利用度低，限制了其临床应用。纳米技术，特别是聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米颗粒，可提高疏水性天然产物的溶解度、稳定性及靶向递送效率。既往研究虽分别探究了HES或PLGA纳米颗粒在睾丸保护中的潜力，但尚未有研究将HES纳米封装与顺铂诱导的睾丸毒性模型及铁死亡信号通路整合分析。因此，本研究旨在系统评估HES-PLGA-NPs在顺铂诱导大鼠睾丸损伤中的保护作用，并与游离HES进行比较，同时探讨其涉及的NRF2/HO-1抗氧化、NF-κB炎症及ACSL4/GPX4/SLC7A11铁死亡信号调节机制。

**二、研究概述与结论**

研究人员采用60只成年雄性Sprague Dawley大鼠，随机分为6组（对照组、HES组、HES-PLGA-NPs组、CIS组、CIS+HES组、CIS+HES-PLGA-NPs组），连续处理4周。CIS组腹腔注射顺铂（7.5 mg/kg/周），HES及纳米HES组口服等剂量HES（50 mg/kg/天）。通过检测生殖激素、睾丸重量、精子参数、氧化应激与抗氧化标志物、炎症因子、凋亡指标、铁死亡相关标志物、组织病理学及GPX4/ACSL4免疫组化表达，全面评估保护效果。结果表明，CIS严重损伤睾丸功能，而HES-PLGA-NPs明显优于游离HES，能更有效地恢复激素水平、改善精子质量、减轻氧化应激、抑制NF-κB炎症、抗凋亡及抗铁死亡，并近乎完全恢复生精小管结构。该研究首次将纳米增强HES递送、体内睾丸保护及铁死亡信号整合分析，为化疗期间男性生殖保护提供了新策略。论文发表在《Antioxidants》。

**三、主要关键技术方法**

研究人员采用单乳液-溶剂蒸发法制备HES-PLGA-NPs，通过动态光散射（Zetasizer Nano ZS）测定粒径、多分散指数（PDI）及Zeta电位，透射电镜（TEM）观察形态，傅里叶变换红外光谱（FTIR）验证药物封装，透析膜扩散法测定体外释放曲线。动物实验使用60只成年雄性Sprague Dawley大鼠（来自埃及曼苏拉大学医学实验研究中心），随机分组后腹腔注射顺铂、口服HES或纳米HES。采用ELISA试剂盒检测血清激素及睾丸组织氧化应激、炎症、凋亡、铁死亡相关蛋白；RT-qPCR检测NRF2、HO-1、NF-κB、ACSL4、GPX4、SLC7A11等mRNA表达；H&E染色评估组织病理学；免疫组化半定量分析GPX4及ACSL4表达。统计分析采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey HSD事后检验。

**四、研究结果**

**3.1 HES-PLGA-NPs的理化表征**
通过TEM观察到纳米颗粒呈球形、离散均匀；动态光散射显示平均粒径49 nm，PDI=0.201，Zeta电位-39.13 mV，包封率（EE）达88.17%，表明纳米悬浮液均一稳定。

**3.2 体外释放曲线**
HES-PLGA-NPs呈双相释放：前8小时爆发释放约35.4%，随后缓慢持续释放，72小时累积释放87.5%，适合持续给药。

**3.3 FTIR表征**
FTIR光谱显示HES与PLGA特征峰在纳米颗粒中保留但略有偏移，无新峰出现，表明HES成功封装于PLGA基质中，存在弱氢键作用但无共价键改变。

**3.4 对生殖激素的影响**
CIS组血清睾酮、LH、FSH显著降低（分别下降44.5%、54.2%、45.5%）。HES部分恢复，而HES-PLGA-NPs使睾酮基本恢复正常（与对照无显著差异），FSH和LH恢复更显著，优于游离HES（p<0.0001）。

**3.5 对睾丸重量及精子质量的影响**
CIS组睾丸重量降低28.6%，精子浓度、活力、存活率分别下降42.3%、46.8%、38.9%，畸形精子增加2.89倍。HES-PLGA-NPs使睾丸重量、精子浓度、活力、存活率分别恢复1.32、1.55、1.70、1.54倍，畸形率降低33.6%，效果显著优于HES。

**3.6 对氧化应激、Nrf2/Ho-1信号及抗氧化防御的影响**
CIS组MDA、NO、8-OHdG升高2.16~4.78倍，NRF2蛋白、mRNA和HO-1蛋白降低55.6%、47.3%、49.7%，SOD、CAT、GSH降低65.5%、46.3%、63.3%。HES-PLGA-NPs使MDA、NO、8-OHdG分别降低49.0%、52.8%、59.6%（MDA和NO接近对照），NRF2蛋白和mRNA恢复至对照水平，SOD和CAT也恢复至正常，显著优于HES。

**3.7 对NF-κB信号及炎症介质的影响**
CIS组NF-κB蛋白和mRNA分别升高6.69和3.42倍，TNF-α、IL-6、IL-1β升高2.89、2.24、1.80倍。HES-PLGA-NPs抑制NF-κB蛋白和mRNA表达60.6%和47.8%，降低TNF-α、IL-6、IL-1β分别48.1%、48.0%、39.5%，其中IL-1β接近正常，效果显著优于HES。

**3.8 对凋亡标志物的影响**
CIS组Bax和caspase-3升高1.98和1.91倍，Bcl-2降低70.7%。HES-PLGA-NPs降低Bax和caspase-3（caspase-3恢复至对照水平），升高Bcl-2 2.53倍，优于HES。

**3.9 对铁死亡相关标志物的影响**
CIS组Fe²⁺、TFR1、脂质ROS、ACSL4 mRNA、4-HNE升高6.72、2.65、3.18、3.08、2.39倍，GPX4 mRNA和SLC7A11降低32.0%和64.5%。HES-PLGA-NPs使Fe²⁺、TFR1、脂质ROS、ACSL4、4-HNE分别降低72.9%、52.5%、59.9%、65.7%、52.9%，脂质ROS、ACSL4、4-HNE接近对照；GPX4和SLC7A11恢复至对照水平，效果显著优于HES。

**3.10 对组织病理学改变的影响**
CIS组生精小管结构严重破坏，生精上皮变薄、核固缩、核碎裂。HES-PLGA-NPs组生精小管结构接近正常，仅见轻微空泡化，生精活动活跃，保护效果优于HES。

**3.11 对GPX4免疫组化表达的影响**
CIS组GPX4免疫评分降低72.1%。HES-PLGA-NPs使GPX4评分升高3.24倍，恢复至对照水平（p=0.887），优于HES。

**3.12 对ACSL4免疫组化表达的影响**
CIS组ACSL4免疫评分升高4.42倍。HES-PLGA-NPs使ACSL4评分降低67.9%，接近对照（p=0.498），显著优于HES。

**五、讨论与结论总结**

讨论部分指出，顺铂通过诱导氧化应激、炎症、凋亡及铁死亡，导致睾丸结构和功能严重损伤。HES-PLGA-NPs通过多途径协同保护：激活NRF2/HO-1抗氧化通路，抑制NF-κB介导的炎症反应，下调Bax/caspase-3并上调Bcl-2抗凋亡，以及上调GPX4/SLC7A11、下调ACSL4/Fe²⁺/脂质ROS/4-HNE以抗铁死亡。纳米制剂因PLGA封装提高了HES的口服生物利用度、胃肠道稳定性及缓释特性，从而显著增强保护效果。但需注意，本研究未在荷瘤模型中进行，未评估对顺铂抗肿瘤活性的影响，且未进行药代动力学及组织分布分析，机制关联性而非因果性。未来需结合铁死亡抑制剂、基因敲除及肿瘤模型进一步验证。

**研究结论翻译**：总之，在本大鼠模型中，顺铂给药与严重的睾丸毒性相关，表现为内分泌紊乱、精子发生障碍、氧化和亚硝化应激、炎症激活、凋亡相关改变及铁死亡相关改变，最终导致睾丸结构和功能显著损伤。在本实验条件下，HES及其PLGA纳米制剂处理均与这些改变的显著减轻相关，其中HES-PLGA-NPs持续表现出比游离HES更大幅度的减轻。与游离HES相比，HES-PLGA-NPs给药与血清睾酮、FSH和LH的更显著恢复，精子质量和睾丸重量改善，以及抗氧化标志物（包括NRF2/HO-1和经典酶抗氧化剂）水平升高相关。同时，其与更低的NF-κB相关炎症标志物、凋亡标志物及铁死亡相关标志物（ACSL4/GPX4/SLC7A11、Fe²⁺、脂质ROS、4-HNE）相关，并伴有更好的生精小管结构保存和活跃精子发生。这些发现表明，在本研究特定条件下，HES-PLGA-NPs与比游离HES更强的保护作用相关；然而，该结论基于关联性的生化、分子和组织学终点，而非正式的因果检验（如通路特异性抑制剂、敲除模型或体外机制实验），且需要药代动力学、生物分布和组织蓄积研究来阐明这种增强疗效的机制。总体而言，这些临床前发现将HES-PLGA-NPs确定为一种有前景的纳米抗氧化剂候选物，值得进一步研究以减轻顺铂诱导的睾丸损伤并支持化疗期间的男性生殖功能。鉴于本研究在非荷瘤大鼠中进行，时间跨度较短，且依赖关联性而非机制性证据，其治疗潜力尚待确定，不应直接外推至临床使用。未来的研究需纳入通路特异性机制实验（如铁死亡抑制剂、NRF2/NF-κB/铁死亡靶点的药理或遗传调节），以及药代动力学、生物分布、长期生育力、肿瘤模型和全面安全性评估，才能确立HES-PLGA-NPs的临床治疗潜力。