神经免疫评分定义结直肠癌中与不良预后相关的基质-神经和免疫分离微环境

《International Journal of Molecular Sciences》：A Neuro-Immune Score Defines a Stromal–Neural and Immune-Segregated Microenvironment Associated with Poor Prognosis in Colorectal Cancer

　　

结直肠癌（CRC）的进展和治疗反应不仅由肿瘤内在程序决定，还受肿瘤微环境中的神经、基质和免疫成分影响。然而，能够共同捕捉神经/基质重塑和免疫激活且具有生物学可解释性的转录组评分仍然有限。研究人员开发了一种神经免疫评分（NIS），定义为神经/基质模块评分减去免疫激活模块评分。NIS利用TCGA-COAD/READ联合结直肠癌队列构建，并在独立的Gene Expression Omnibus（GEO）数据集中进行外部评估。进一步整合了单细胞RNA测序、聚焦配体-受体分析和空间转录组学，以表征NIS相关生物学的细胞起源、空间组织及潜在机制。高NIS（NIS-high）与批量转录组队列中的不良预后相关。外部验证显示，高NIS在GSE39582中与更差的无病生存期/无复发生存期（DFS/RFS）显著相关，在GSE17536中与更差的总生存期（OS）显著相关。多队列荟萃分析进一步支持NIS-high与不良临床结局之间的一致性关联。单细胞分析将NIS-high信号主要定位于胶质样细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞和恶性上皮细胞，而CD8⁺ T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）则表现出低NIS。聚焦配体-受体分析提示，NIS-high细胞区室可能通过MIF-CD74/CXCR4、SPP1-CD44、细胞外基质（ECM）-整合素、TGF-β和免疫检查点相关轴与免疫和肿瘤区室进行通讯。空间转录组学进一步表明，NIS-high区域富集于基质、神经/胶质样、血管/周细胞和肿瘤-基质生态位，而NIS-low区域与免疫激活和细胞毒性T/NK细胞富集区相关。NIS捕捉了结直肠癌微环境的一种空间组织状态，其特征为神经/基质重塑、ECM和血管/周细胞生态位激活，以及免疫激活的相对减少或空间分离。NIS可能作为一种与不良结局相关的生物学可解释的微环境分层评分，并为未来针对基质重塑、髓系介导的免疫调节、神经相关信号及抗肿瘤免疫的研究提供框架。

**论文解读：神经免疫评分（NIS）定义结直肠癌中与不良预后相关的基质-神经和免疫分离微环境**

**研究背景与问题**
结直肠癌（CRC）是全球常见的恶性胃肠道肿瘤，其发生、进展和临床结局受遗传易感性、炎症、饮食、药物暴露及宿主-环境因素等多重影响。尽管美国癌症联合委员会（AJCC）分期系统是临床决策的核心依据，但同一分期的患者预后差异显著，提示需要超越传统临床病理变量的生物学可解释生物标志物来细化风险分层。近年来，神经系统与癌症之间的相互作用受到关注：中枢神经系统（CNS）和周围神经系统（PNS）均参与多种癌症的调控，神经可通过释放降钙素基因相关肽等分子抑制效应T淋巴细胞，雪旺细胞可促进M2型巨噬细胞极化并加速肿瘤生长；肠道拥有自身的内在神经系统——肠神经系统，肠血清素能神经元释放5-羟色胺激活Wnt/β-catenin信号通路，驱动CRC干细胞自我更新。此外，神经周围浸润（PNI）和标准化神经密度（NND）是影响患者生存的关键因素，PNI在胃肠道肿瘤中的发生率为13%-39%。因此，开发靶向神经系统的生物标志物和治疗策略是CRC研究的重要方向。研究人员假设神经-基质活性与抗肿瘤免疫活性之间的平衡可通过可解释的转录组神经免疫评分（NIS）来捕捉，并评估NIS与预后的相关性，阐明其细胞和空间基础。

**研究内容与结论**
研究人员在TCGA-CRC队列中构建NIS（定义为神经/基质模块评分减去免疫激活模块评分），并在独立GEO队列中验证其预后价值，结合单细胞RNA测序、聚焦配体-受体分析和空间转录组学解析其生物学机制。结论：高NIS（NIS-high）与批量转录组队列中的不良预后显著相关，在GSE39582中与更差的无病生存期/无复发生存期（DFS/RFS）相关，在GSE17536中与更差的总生存期（OS）相关；多队列荟萃分析进一步支持这种关联。单细胞分析显示NIS-high信号主要定位于胶质样细胞、成纤维细胞、周细胞、内皮细胞和恶性上皮细胞，而CD8⁺ T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）呈低NIS。聚焦配体-受体分析提示NIS-high区室可能通过MIF-CD74/CXCR4、SPP1-CD44、细胞外基质（ECM）-整合素、TGF-β和免疫检查点相关轴与免疫和肿瘤区室通讯。空间转录组学表明NIS-high区域富集于基质、神经/胶质样、血管/周细胞和肿瘤-基质生态位，而NIS-low区域与免疫激活和细胞毒性T/NK细胞富集区相关。该研究发表于《International Journal of Molecular Sciences》。

**关键技术方法**
1. **队列与数据来源**：利用TCGA-COAD/READ联合队列（n=624）作为发现队列，外部验证来自GEO数据库的GSE39582、GSE17536、GSE17537和GSE14333等独立CRC队列。
2. **NIS构建**：基于文献预定义的神经/基质模块（NC，21个基因，含雪旺细胞/胶质标志物、神经营养因子、轴突导向、神经相关基质重塑基因）和免疫激活模块（IA，28个基因，含细胞毒性效应、T细胞标志物、抗原呈递、免疫检查点基因），对每个基因进行z-score标准化，计算模块平均z-score，NIS = NC评分 - IA评分，以中位数分为高/低组。
3. **单细胞RNA测序分析**：使用GSE132465数据集（23例患者，61,370个细胞），计算细胞级NIS，并进行聚焦配体-受体分析（如MIF-CD74/CXCR4、SPP1-CD44、ECM-整合素等轴）。
4. **空间转录组学分析**：利用Valdeolivas等处理的CRC空间转录组数据（12张切片，17,326个斑点），计算斑点级NIS，结合病理学家注释和反卷积细胞类型标签定位。
5. **统计与荟萃分析**：Kaplan-Meier曲线、Cox比例风险模型、随机效应荟萃分析（DerSimonian-Laird法）评估预后关联；差异表达、基因集富集分析（GSEA）和自定义模块评分解析生物学特征。

**研究结果**
**2.1 NIS的构建及其在TCGA CRC中的分析结果**
在TCGA-CRC联合队列中，以中位NIS（0.037130）为界，将624例患者分为NIS-low（n=312）和NIS-high（n=312）。Kaplan-Meier分析显示NIS-high组总生存期（OS）显著更差（log-rank p=0.0365）。单变量Cox回归中，二分类NIS（高vs低）与OS显著相关（HR=1.46，95% CI 1.02-2.08，p=0.0377），但连续NIS未达统计学意义（HR=1.24，p=0.090）。多变量调整（年龄、性别、分期）后，NIS-high与OS关联方向一致但失去显著性（HR=1.23，p=0.357），提示NIS预后效应部分与临床病理因素重叠。敏感性分析（替代截断值、连续NIS）结果一致，NIS更多作为风险相关微环境特征而非独立预后模型。

**2.2 NIS揭示TCGA CRC中的神经免疫表型特征**
差异表达分析（FDR<0.05，|log2FC|≥0.5）鉴定出371个显著差异基因，NIS-high组中74个上调、297个下调。下调基因主要涉及免疫激活（JCHAIN、CXCL10、CXCL9、HLA-DRA、GZMA、CCL5、IDO1、NKG7、CD3D、CD8A），上调基因包括NKD1、SYT7、PALD1、MEX3A、PMEPA1、MYH11、SYNM、RNF43、HSPB7、ALKAL1。GO和KEGG富集分析表明NIS-high肿瘤呈低免疫激活和显著神经/基质重塑状态。MSigDB Hallmark基因集富集分析（GSEA）显示NIS-high方向富集肌生成、上皮-间充质转化、Hedgehog、Wnt/β-catenin、血管生成、TGF-β、Notch信号通路；而干扰素-γ反应、同种异体排斥、炎症反应、干扰素-α反应、补体、TNFα/NF-κB、IL2/STAT5、IL6/JAK/STAT3、抗原/免疫相关特征显著负向富集。自定义模块评分分析进一步证实NIS-high组免疫相关模块（细胞毒性T/NK、抗原呈递、免疫检查点抑制、T细胞耗竭、巨噬细胞/单核细胞）评分降低，而神经-基质模块（神经元导向、NC核心神经、ECM重塑、CAF/成纤维细胞、EMT）评分升高。免疫检查点基因（IDO1、LAG3、HAVCR2、CD274、PDCD1、CTLA4）在NIS-high组均显著下调。综上，NIS-high表型反映神经增强/免疫冷表型。

**2.3 NIS预后价值在独立GEO队列中的外部验证**
在主要外部验证队列GSE39582（n=557，177个事件）中，NIS-high组DFS/RFS显著更差（log-rank p=0.00028），单变量Cox HR=1.74（95% CI 1.28-2.35，p<0.001），多变量调整后仍显著（HR=1.74，p=0.00038）。在GSE17536（n=177，73个OS事件）中，NIS-high与OS显著相关（单变量HR=1.91，p=0.008；多变量HR=1.95，p=0.016）。GSE17537和GSE14333中方向一致但未达统计学意义。荟萃分析：OS汇总HR=1.57（95% CI 1.20-2.06，p=0.001），DFS/RFS汇总HR=1.60（95% CI 1.26-2.03，p<0.001），均支持NIS-high与不良预后相关。外部GEO队列中，NIS-high肿瘤普遍呈现神经/基质、CAF、ECM、间充质相关特征升高，细胞毒性免疫、抗原呈递、免疫检查点相关特征降低，与TCGA发现一致。

**2.4 NIS与已有转录组分类器的比较**
在TCGA-CRC中，与免疫、基质、EMT、CAF/ECM、细胞毒性T/NK评分及探索性CMS样亚型比较，NIS与基质、EMT、CAF/ECM评分呈弱正相关（Spearman rho=0.156-0.165），与免疫和细胞毒性T/NK评分呈强负相关（rho=-0.785和-0.749）。NIS在CMS4样间质肿瘤中最高，CMS1样免疫肿瘤中最低（Kruskal-Wallis p=2.11×10^-35）。在CMS4样亚组中，NIS-high显示非显著性趋势（HR=1.77，p=0.069）。NIS的调整后C-index（0.738）在二分类转录组评分中数值最高，但较临床模型改善微小（ΔC-index=0.0018），提示其预后性能与已有评分相当，主要价值在于补充生物学可解释性。

**2.5 单细胞分析识别NIS的细胞和通讯基础**
在GSE132465单细胞数据集中，NIS主要富集于非免疫区室：基质细胞平均NIS最高（0.784），上皮细胞（0.361），而T细胞为负值（-0.631）。精细细胞类型分析显示高NIS定位于胶质细胞、成纤维细胞、周细胞、高内皮微静脉（HEV）内皮细胞和CRC细胞；细胞毒性CD8⁺ T细胞、效应记忆CD8⁺ T细胞、耗竭样CD8⁺ T细胞和NK细胞呈强负值。肿瘤上皮细胞NIS高于正常上皮，而肿瘤浸润T细胞NIS低于正常T细胞。聚焦配体-受体分析提示NIS-high区室可能通过MIF-CD74/CXCR4、SPP1-CD44、ECM-整合素、免疫检查点、TGF-β、趋化因子、血管和神经导向相关轴与免疫和肿瘤区室通讯。通路层面最强信号涉及细胞因子/髓系免疫调节、ECM-整合素基质屏障信号、SPP1介导的巨噬细胞-基质互作和免疫检查点信号。

**2.6 空间转录组学验证NIS生物学的组织定位**
在Valdeolivas等CRC空间转录组数据（12张切片，17,326个斑点）中，高NIS主要定位于基质和肿瘤-基质区域。病理学注释显示最高平均NIS位于低免疫细胞浸润的促结缔组织增生基质（0.219）、中高免疫细胞浸润的肿瘤-基质区域（0.135）和肌肉层/基质中的免疫细胞聚集区（0.133）；而黏膜下层或基质/肌肉层中的多个免疫细胞聚集区呈低或负NIS。反卷积空间细胞类型标签显示最高NIS在肠胶质细胞（0.850），其次为基质1（0.359）、基质3（0.173）、尖端样内皮细胞（0.161）和周细胞（0.135）；CD8⁺ T细胞、NK细胞、Th17细胞和SPP1⁺免疫相关区域呈低或负NIS。斑点级标记物相关性分析显示NIS与神经/基质或ECM标志物（SOX10、COL3A1、COL1A1、FN1、NGFR、S100B）正相关，与免疫激活和抗原呈递标志物（CD8A、GZMB、HLA-DRA）负相关。跨切片模式显示NIS阳性信号在基质、肿瘤-基质和免疫细胞中等区域重复出现，而非肿瘤上皮或排除区域通常呈低或负NIS。

**讨论与结论**
讨论部分总结：NIS捕捉了神经/基质程序与免疫激活程序之间的平衡，在批量转录组、单细胞和空间水平均一致显示高NIS对应神经/基质重塑、ECM组织、血管/周细胞生态位，以及细胞毒性免疫活性相对降低或空间分离的微环境状态。NIS与不良预后关联在发现和验证队列中均观察到，GSE39582和GSE17536尤为显著，多队列荟萃分析进一步支持。单细胞和空间分析将NIS信号定位于基质、胶质样、成纤维、周细胞、内皮和恶性上皮细胞，而细胞毒性免疫群体呈低NIS，表明NIS反映肿瘤生态系统中不同区室的相对贡献。NIS与CMS4部分重叠但独特地纳入神经/基质与免疫激活平衡，其价值在于补充生物学可解释性。潜在机制包括神经/胶质样程序通过神经营养因子和轴突导向分子促进肿瘤进展，基质和ECM重塑形成物理屏障限制免疫细胞进入，以及髓系调节（如MIF-CD74/CXCR4和SPP1-CD44轴）参与免疫抑制。翻译意义：NIS可能帮助识别神经/基质高、免疫激活低的肿瘤，需联合免疫检查点阻断与TGF-β、CXCR4、SPP1/CD44、CAF/ECM重塑、血管/周细胞或神经相关信号靶向治疗。局限性包括回顾性设计、外部验证队列异质性、单细胞和空间分析仅提供假设生成证据、缺乏蛋白质水平验证和免疫治疗反应预测数据。

研究结论部分翻译：总之，本研究将NIS确定为一种与CRC不良结局相关的可解释的神经免疫微环境评分。多层次验证表明，NIS-high肿瘤的特征在于神经/基质和ECM重塑、血管/周细胞相关生态位、髓系和基质免疫调节，以及细胞毒性免疫激活的减少或空间分离。这些发现为理解神经-基质重塑与免疫失衡如何在CRC进展中协同作用提供了框架，并为未来基于生物标志物和微环境靶向治疗的研究生成假设。