《International Journal of Molecular Sciences》：Application of Proximity-Labeling Techniques in Plants: A Review of Successful Cases
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新一代测序（NGS）目前被认为是检测非小细胞肺癌（NSCLC）中可干预变异的优选方法。基于RNA的NGS在检测基因融合方面尤为高效，并可分析相关基因的mRNA表达水平。本研究描述了一种基于cDNA末端5'快速扩增（5' RACE）和锚定多重PCR的新型靶向RN
新一代测序（NGS）目前被认为是检测非小细胞肺癌（NSCLC）中可干预变异的优选方法。基于RNA的NGS在检测基因融合方面尤为高效，并可分析相关基因的mRNA表达水平。本研究描述了一种基于cDNA末端5'快速扩增（5' RACE）和锚定多重PCR的新型靶向RNA测序文库制备流程。该NGS panel设计用于分析15个与NSCLC治疗决策相关的基因（ALK、BRAF、CD274（PD-L1）、EGFR、ERBB2（HER2）、KRAS、MET、NRAS、NRG1-2、NTRK1-3、RET和ROS1）。针对168例NSCLC样本，将该方法与PCR进行了验证。该NGS方法成功检出了此前由PCR鉴定的所有85个突变，并在83例PCR阴性样本中确认了82例不存在所测试突变。唯一一例不一致样本随后经数字液滴PCR分析，显示突变等位基因比例较低。随后，该新设计的NGS panel被用于分析272例来自年轻（≤50岁）且经PCR检测未发现驱动突变或PCR分析失败患者的癌组织。NGS在240例（88.2%）样本中成功检测，包括35例（64.8%）PCR失败的样本。在55例肿瘤中检测到驱动突变，包括三个此前未报道的融合（PAPLN::ALK、CD55::ROS1和FKBP15::RET）。研究人员得出结论，基于5' RACE的RNA测序是NSCLC分子检测的一种可行方法。
**论文解读：基于5' RACE的靶向RNA测序在非小细胞肺癌分子检测中的应用**
**研究背景与问题**
非小细胞肺癌（NSCLC）的临床管理需检测广泛的分子改变，包括EGFR、ALK、ROS1、NTRK1-3、RET等基因的突变与融合，以及MET exon 14跳跃、KRAS与BRAF特定替换、HER2激活改变和PD-L1表达。随着分子靶向治疗格局的演变，单基因连续检测日益繁琐且效率低下。新一代测序（NGS）虽被认为是NSCLC分子分型的优选方法，但现有商业NGS panel通常覆盖数百个基因，仅小部分与NSCLC相关，且需要中高通量仪器，不利于医院实验室应用。更重要的是，目前常用的DNA-based NGS检测难以有效检测酪氨酸激酶重排。RNA-based NGS在检测可干预基因融合方面具有显著优势，并能可靠鉴定激活致癌突变，尤其适合肿瘤细胞含量低的临床样本。然而，RNA-based方法无法直接检测基因扩增，但功能性扩增可表现为mRNA表达升高，可通过靶向RNA测序测量。此外，PD-L1的免疫组化（IHC）仍是标准方法，但mRNA与蛋白表达的一致性有待验证。为此，研究人员开发了一种基于cDNA末端5'快速扩增（5' RACE）和锚定多重PCR的新型靶向RNA测序流程，旨在实现NSCLC相关基因的全面高效检测。
**主要技术方法**
该研究采用基于5' RACE的靶向RNA测序文库制备流程，核心步骤包括：使用Moloney鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶进行逆转录反应并立即进行模板转换反应；利用Taq DNA聚合酶合成第二链cDNA并进行索引；通过锚定多重PCR富集文库；随后进行扩增、二次索引和大小选择。所有样本均来源于N.N. Petrov肿瘤研究所（俄罗斯圣彼得堡）2023-2025年间的连续NSCLC患者。验证阶段使用186例肿瘤样本，后续分析纳入272例年轻（≤50岁）患者样本，这些患者经PCR检测未发现驱动突变或PCR分析失败。生物信息学分析使用UMI-tools、STAR、STAR fusion、Arriba等工具进行去重、比对、融合检测及变异鉴定。
**研究结果**
**2.1. 5' RACE-based靶向RNA测序panel的验证**
通过比较186例连续NSCLC患者的NGS结果与PCR数据，发现：2例（1.1%）NGS分析失败，16例（8.6%）覆盖率低。在168例高质量NGS结果中，与PCR高度一致：85例肿瘤为突变阳性，82例为野生型。唯一不一致的样本中，RNA NGS检出KRAS p.G12D突变（突变等位基因比例约6%），而PCR为野生型，经数字液滴PCR确认DNA水平有2%突变等位基因。NGS成功鉴定的变异包括ALK、RET、ROS1融合，BRAF V600E突变，EGFR点突变及缺失/插入，HER2 exon 20插入，KRAS密码子12/13/61突变，MET exon 14跳跃，NRAS密码子61突变等。在8例NGS覆盖率低但PCR阳性的样本中，7例仍成功检出相应改变，但1例EML4::ALK融合未被检出。
**2.2. 年轻肺癌患者癌组织分析**
对272例年轻（≤50岁）NSCLC患者肿瘤样本进行分析，NGS成功检测240/272例（88.2%），19例覆盖率低，13例分析失败。在54例部分或全部PCR失败的肿瘤样本中，35例（64.8%）成功通过NGS分析。驱动突变在51/240例（21.3%）成功检测样本和4/19例（21.0%）低覆盖率样本中被发现，包括ALK、ROS1、RET、NTRK2融合各16、6、4、1例，以及NRG1融合（3例）和BRAF融合（1例）。其他变异包括EGFR、ERBB2、KRAS、BRAF基因的激活突变。25例发现PCR未覆盖的罕见嵌合基因变异，18例存在PCR panel包含但被遗漏的变异。值得注意的是，11/16例ALK融合阳性样本显示PCR检测的5'/3'端mRNA表达不平衡，而ROS1阳性样本未显示不平衡。PCR失败率在≤50岁患者中为8.7%，NGS失败率在PCR野生型样本中为6.1%，在PCR失败样本中为29.6%，总体NGS失败率估计为8.1%。低肿瘤细胞含量（≤15%）样本中驱动突变检出率（23.9%）略高于高含量样本（19.5%），提示RNA-based NGS在低细胞含量样本中可能更敏感。低RNA输入量样本的NGS失败或低覆盖率概率更高（18.5% vs. 8.9%）。
**2.3. PD-L1表达测量的比较**
对49例年轻NSCLC患者同时进行IHC PD-L1检测和NGS分析，IHC阳性（>1%肿瘤细胞）占10/49（20.4%）。经ROC曲线分析确定PD-L1 mRNA归一化表达值的最佳阈值为0.69，此时NGS方法灵敏度70%，特异性95%，AUC为0.867。由于样本量小，该结果初步，需更大队列验证。假阴性可能归因于PD-L1阳性肿瘤细胞比例低（≤10%）或整体肿瘤细胞含量低，假阳性原因不明。
**讨论与结论**
本研究开发的基于5' RACE的NGS文库制备流程，相比杂交捕获方法具有文库制备时间短（1-2个工作日）、无需接头连接、仅需两种常用酶（M-MLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶）等优势，成本更低。验证实验证明了其良好性能。在年轻NSCLC患者中，NGS从54例PCR失败的样本中成功分型35例（64.8%），并发现9.9%的野生型或PCR失败样本存在ALK、ROS1、RET或NTRK2融合阳性，其中44.4%的融合涉及罕见基因伙伴，包括三个此前未描述的融合（PAPLN::ALK、CD55::ROS1、FKBP15::RET）。这些罕见融合可被现有酪氨酸激酶抑制剂靶向，具有重要临床意义。此外，研究还发现一例最初诊断为肺腺癌的26岁女性患者实为炎性肌纤维母细胞瘤，强调了NGS在年轻患者分子分型中的重要性。总体而言，标准PCR在785例早期发病NSCLC患者中鉴定出322例（41%）治疗靶点，而后续NGS额外发现45例（5.7%）临床可干预改变。尽管PD-L1 mRNA表达与IHC的一致性有限，但5' RACE-based RNA测序方法能够鉴定广泛的重要基因融合和其他驱动突变，是现有商业panel的可行且经济替代方案。研究结论：基于5' RACE的靶向RNA测序方法适用于NSCLC样本中临床重要基因融合和其他激活驱动突变的鉴定，是一种可行且负担得起的替代方案。
