综述：基于先进分析技术驱动的口腔抗菌发现管线

《Molecules》：Oral Cavity Antibacterial Discovery Pipeline Driven by Advanced Analytical Techniques

　　

口腔是一个极其复杂且动态的微生物生态系统，能够快速适应抗菌胁迫。这些特征使其成为鉴定具有治疗潜力的新型生物活性分子的有前景的环境。同时，牙科和口腔颌面部感染中耐药病原体的日益流行凸显了当前治疗策略的局限性，以及对新有效抗菌药物的迫切需求。本综述探讨了先进分析技术的核心作用，特别强调质谱（MS），在发现和表征与未来抗菌发现以及理解对病原体或治疗干预的生物学反应相关的生物活性代谢物和生物标志物方面的作用。综述讨论了代谢组学方法、成像质谱（IMS）和生物信息学平台的整合如何通过加速活性化合物的鉴定和改善对口腔内微生物相互作用的理解来改变抗菌发现过程。总之，本工作提供了关于口腔 microbiome 作为生物活性分子和生物标志物来源的最新知识概览，并强调了新兴分析技术如何为开发针对耐药性口腔感染的创新治疗策略开辟新视角。

1. 1.
   引言
   抗菌耐药（AMR）是一个日益严重的全球公共卫生挑战，耐药感染导致的发病率、死亡率和经济负担稳步增加。尽管AMR传统上与医院或全身感染相关，但越来越多的证据表明口腔的作用比先前认识的中心。口腔 microbiome 是一个复杂且高度有序的群落，微生物通过协同和拮抗相互作用决定健康或疾病。其高微生物密度和持续暴露于环境及治疗选择压力，使口腔成为抗菌耐药特征出现和传播的热点。因此，口腔 microbiome 尤其是口腔宏蛋白质组，已被广泛研究作为口腔和全身疾病的功能生物标志物来源。蛋白质组学特征不仅反映分类变化，还反映微生物群落的功能状态，提供超越宏基因组学的见解。然而，尽管口腔耐药组（resistome）的基因组特征不断增加，对抗性决定因素及其实际代谢表达的功能理解仍然有限。仅宏基因组分析不足以鉴定口腔生物膜内有效产生的抗菌代谢物。
   近期研究进一步强调了口腔生物膜中显著的微生物和代谢多样性，表明该环境也可作为具有生态和治疗相关性的生物活性分子的储存库。宏基因组研究揭示了丰富且动态的口腔耐药组，其特征是大量抗菌耐药基因（ARGs）和可移动遗传元件（MGEs），以及口腔微生物积累和交换耐药决定因素的能力。健康受试者与龋齿或牙周炎患者之间耐药组组成的差异表明，口腔微生物群落对环境和治疗压力高度敏感。解决这一差距不仅需要高分辨率分析方法，还需要改善宿主相关细菌的基因可操作性。Waller 等人强调，开发强大的遗传工具对于耐药决定因素的功能验证和阐明生物活性代谢物产生的生物合成途径至关重要。在此背景下，需要一个能够将基因潜力与实际生物活性代谢物产生联系起来的综合框架。临床上，牙科和口腔颌面部感染中耐药病原体的日益检出凸显了当前治疗策略的局限性，对新抗菌药物的迫切需求。因此，口腔不仅是一个被低估的抗菌耐药储存库，也是新型抗菌分子的有前景来源。
   在此背景下，基于质谱（MS）的分析技术正在成为发现和表征口腔生态系统内抗菌代谢物的变革性工具。其高灵敏度和分辨率能够鉴定共生和病原微生物产生的生物活性化合物、分析对抗菌胁迫的代谢反应，并检测罕见或先前未表征的代谢物。基于 MS 的方法可以直接将基因潜力与实际生物活性代谢物的产生联系起来，从而克服传统基因组分析的一些局限性。此外，成像质谱的整合正在重塑口腔抗菌发现，为开发针对牙周病、种植体周围感染和其他生物膜相关疾病的创新治疗策略提供新机会。
   本综述提供了一个概念框架，以理解基于 MS 的方法如何重塑口腔生态系统内的抗菌发现。尽管口腔 microbiome 包括细菌、真菌、古菌和病毒，它们在高度结构化的生物膜群落中相互作用，但本综述主要关注细菌群落。这一选择反映了该领域的现状，即基于 MS 的抗菌发现通道主要围绕细菌代谢物、蛋白质和生物膜相关机制开发，而对其他微生物领域的可比应用仍相对未探索。特别地，真菌类群如念珠菌（Candida）属是口腔 microbiome 的重要组成部分；然而，专门针对口腔真菌的基于 MS 的代谢组和蛋白质组工作流仍然有限。因此，本综述未广泛涵盖真菌群落，尽管其生态和致病相关性强调了未来研究的必要性。
   首先，我们描述了抗菌发现管线的演变以及当前对口腔耐药组及其功能表达的理解，强调了传统发现策略的局限性和推动这一转变的技术进步。然后，我们检查了用于抗菌发现的主要基于 MS 的分析平台，包括宏蛋白质组学、非靶向代谢组学、成像质谱（IMS）和分子网络，批判性地讨论了它们的分析能力、方法学局限性和在口腔微生物学中的新兴应用。最后，我们探讨了这些互补技术的整合如何实现新型抗菌代谢物和治疗靶点的鉴定，并讨论了将这些发现转化为针对生物膜相关口腔感染的创新策略的剩余挑战。
2. 2.
   抗菌发现管线
   新抗菌药物的发现已成为生物医学研究中最紧迫的优先事项之一。在此背景下，抗菌发现管线可以定义为一个结构化的决策框架，它随着技术进步和概念转变而逐步演变。现代发现越来越依赖于迭代、模块化和数据驱动的策略，其中微生物学、分析化学、药理学、计算生物学和多组学方法密切协同，而不是遵循严格线性的实验步骤序列。
   传统上，抗菌发现遵循顺序工作流，从表型筛选到苗头化合物（hit）鉴定、先导化合物优化，最后进行药代动力学和毒理学评估。尽管这一策略导致了许多临床成功抗生素的发现，但它不再足以应对当前的治疗挑战。多重耐药细菌的快速出现，加上新抗菌类别数量有限和易于成药靶点的逐渐耗尽，暴露了经典发现范式的局限性。最近的分析表明，传统管线通常缺乏微生物学、药物化学、药理学和转化生物学之间的有效整合，导致临床前和临床开发期间预测性能差和高损耗率。因此，尽管研究努力巨大，当前的抗菌管线仍然严重缺乏具有真正新作用机制、能够应对抗菌耐药性日益增长负担的候选药物。
   为了克服这些局限性，一种模块化、迭代和决策驱动的发现框架逐渐出现。Waller 等人提出了一个标志性模型，其中早期靶点验证、作用机制（MoA）阐明、定量渗透性评估和功能性脆弱性分析从开发最早阶段就纳入。该策略促进了化学、微生物学、药理学和系统生物学之间的持续反馈，从而改善决策并减少后期失败。
   这一概念的转变基于五个相互连接的模块，在整个发现过程中持续交换生物学和分析信息。候选优先化不仅依赖于表型活性，还由多个互补证据层指导，包括靶点参与、代谢反应、分子分析和药理学特性。多组学技术、先进质谱、生物信息学和机器学习方法的整合进一步增强了这一框架，使得能够早期鉴定有前景的抗菌候选物，同时减少非特异性或难以转化的化合物的进展。此外，渗透性、药代动力学/药效学（PK/PD）和靶点脆弱性的定量评估现在可以纳入命中前验证阶段，大大提高了发现管线的预测价值。
   高分辨率分析技术，特别是液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）、高分辨率质谱（HRMS）、成像 MS 方法如基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和解析电喷雾电离（DESI）、离子淌度-质谱（IM-MS）、定量蛋白质组学和全局代谢组学，现在在该框架中发挥核心作用。这些技术能够测量细胞内积累和生物转化、将代谢谱与作用机制关联、鉴定功能脆弱途径以及早期重复鉴定（dereplication），从而大幅减少假阳性。然而，结果的稳健性在很大程度上取决于分析和计算工作流的质量。预处理步骤，包括峰检测、对齐、归一化和去卷积，引入了 substantial 变异性，是重现性的主要挑战。
   Wang 等人解决了基于 MS 研究中的一个主要限制，即缺乏用于共享、搜索和整理原始仪器数据的开放协作工具。正如若干方法学综述所强调的，主要瓶颈不再在于仪器本身，而在于对生成的大量数据的解释和管理。现有数据库通常不支持直接基于原始 MS 谱图的搜索。为了解决这个问题，研究人员开发了 GNPS（Global Natural Products Social Molecular Networking），这是一个旨在实现 MS 数据共享、分子网络、协作整理和天然产物发现的在线平台。类似地，Rochat 强调 HRMS 平台如 Orbitrap 和四极杆飞行时间（Q-TOF）仪器能够实现高度强大的组学分析，但需要准确且精心整理的解释。Perez de Souza 等人进一步强调 UHPLC-HRMS 数据集的复杂性限制了有效的代谢组覆盖，而 Du 等人通过评估 124 个 LC-HRMS 代谢组学软件工具，证明了软件平台和数据库之间缺乏标准化仍然是跨研究可比性的主要障碍。
   总体而言，这些研究表明计算层目前是将代谢组学数据转化为可靠生物学知识的主要瓶颈之一。

2.1. LC–MS 平台在模块化管线中的作用

LC-MS 技术在抗菌发现管线的不同阶段执行不同但相互关联的功能。图 2 说明了 LC–MS 平台如何以集成方式支持现代抗菌发现过程的所有阶段。

在发现源阶段（图 2 中的 1），非靶向代谢组学能够鉴定多物种生物膜等复杂系统内产生的代谢物。在筛选和苗头发现阶段（图 2 中的 2），代谢分析有助于鉴定活性化合物、早期重复鉴定和生成关于作用机制的初步假设。在早期分析阶段（图 2 中的 3），代谢改变与渗透性、细胞内积累和细胞毒性数据整合，提供对作用机制（MoA）的初步功能表征。在苗头至先导优化阶段（图 2 中的 4），LC–MS 平台支持候选化合物的药代动力学、代谢稳定性和生物转化评估。最后，在转化决策阶段（图 2 中的 5），多组学和药理学数据的整合指导选择具有最高临床成功概率的化合物。

2.2. 互补技术与多层次整合

高分辨率分析技术由于其高灵敏度、准确性和广泛的分析覆盖范围，对于代谢物发现和表征至关重要。由于这些特征，基于 MS 的方法在非靶向代谢组学研究中特别有价值。在此框架内，几种互补技术有助于改善数据解释和结构分辨率。

IM-MS 引入了基于碰撞截面（CCS）的分离，提高了对异构体物种的区分，并增加了结构鉴定的置信度。Paglia 和 Astarita 的工作是理解 CCS 分离如何增强复杂代谢物和脂质分辨率的关键参考。然而，CCS 辅助注释的更广泛应用受到公开可用 CCS 数据库（如 CCSbase、AllCCS 和 MetCCS）覆盖不全的限制。尽管这些资源大大扩展了 CCS 注释，但它们对微生物代谢物的代表性仍然有限，特别是源自口腔 microbiome 的代谢物。因此，在口腔生物膜中检测的许多代谢物缺乏可靠的 CCS 参考值，降低了基于库的鉴定的有效性，并凸显了对专门定制的实验验证 CCS 库的迫切需求。

成像质谱（IMS）技术如 MALDI 和 DESI 能够直接可视化生物组织和生物膜内代谢物的空间分布。在此背景下，MALDI-IMS 特别适用于结构化和低水合底物，如成熟牙菌斑、生物膜层和牙面，其中基质辅助共结晶增强空间分辨率。相反，DESI-IMS 更适用于高度水合或软基质，包括唾液膜和早期菌斑沉积物，能够在无需广泛样品制备的情况下进行环境电离。

这一能力在口腔环境中特别相关，因为生物膜的三维结构强烈影响代谢相互作用。

然而，口腔生物膜的实用原位 IMS 分析提出了若干挑战。成熟生物膜的三维结构和致密细胞外聚合基质（EPS）会降低电离效率，使 MALDI 中的基质沉积复杂化，并阻碍 DESI 中的均匀解吸。样品制备步骤，如受控切片、优化基质喷雾和温和表面稳定，通常需要保留空间完整性。此外，原生牙生物膜的成像与重建体外生物膜的成像有很大不同。虽然体外模型提供高度受控的实验条件，便于机制研究和方法的优化，但原位成像保留了临床生物膜的天然三维结构、微生物多样性和代谢梯度，从而提供了口腔生态系统更真实的表示。然而，这种增加的生物学相关性是以更大的技术复杂性为代价的，因为牙釉质硬度、水合梯度、表面粗糙度和细胞外基质会对离子产率和空间分辨率产生不利影响。已经开发了几种优化策略，包括定制基质配方、冷冻切片和表面兼容的 DESI 溶剂，以减轻这些限制并提高口腔生物膜中代谢物的可检测性。

在高度异质生态系统背景下，计算机分子注释工具，包括通过碎片树分析推断分子式的 SIRIUS 软件；使用机器学习衍生的指纹预测分子结构的 CSI:FingerID；以及通过深度学习模型分配化合物类别的 CANOPUS，已被证明对从 MS/MS 谱图进行结构预测有价值，从而加速代谢物鉴定和优先化。然而，这些方法主要产生预测性假设，仍需要实验验证，特别是在处理高度复杂谱图时。

表 1 总结了目前用于抗菌发现管线的主要分析技术，强调了它们的主要作用、优势和局限性。

在此背景下，口腔 microbiome 代表了一个理想模型，可以在整个发现管线中整合先进分析技术，从而能够鉴定新型抗菌分子、功能生物标志物和复杂多物种生物膜内的代谢脆弱性。

1. 3.
   口腔 Microbiome 作为生物活性分子和抗菌耐药的来源
   口腔微生物群落复杂且高度有序。微生物紧密生活并建立协同和拮抗相互作用，决定健康或疾病。在平衡条件下，这些相互作用产生稳定且有弹性的网络，维持口腔稳态并保护免受环境扰动。当高糖饮食或炎症等压力超过临界阈值时，平衡被破坏，导致生态失调，有利于龋齿或牙周病。尽管口腔 microbiome 还包括参与这些生态网络的真菌、古菌和病毒，但本综述主要关注细菌群落。这一选择反映了基于 MS 的抗菌发现的现状，主要围绕细菌代谢物、蛋白质和生物膜相关机制开发。因此，特别强调微生物衍生的分子作为新型抗菌剂的潜在来源，而宿主衍生的分子主要作为生物标志物和宿主-微生物组相互作用的指标进行讨论，可能指导抗菌靶点发现。
   口腔生物膜内的相互作用包括粘附和共粘附、营养合作、细胞-细胞信号传导、水平基因转移以及由抗菌化合物介导的竞争。因此，有效的预防需要了解微生物功能而不仅仅是分类组成。
   口腔的复杂性使其成为抗菌耐药的储存库，但也是抗菌发现中生物活性分子的一个有前景且尚未充分探索的来源。口腔 microbiome 作为一个化学生态系统，既是生物活性代谢物的来源，也是抗菌耐药的中心。
   口腔内有非常不同的微生物群落，Kim 等人的研究阐明了其空间组织。研究人员使用先进的成像技术对儿童龋齿影响的牙齿进行观察，识别出微生物群落组织成三维冠状结构，其中变形链球菌（Streptococcus mutans）不仅与龋齿相关，而且通过产生细胞外基质主动构建这种结构，将其他微生物组织在其周围。这种结构充当对抗抗菌剂的屏障，并创造酸性环境，促进疾病进展。这项研究为口腔 microbiome 的功能组织提供了重要见解。
   微生物组的空间结构调节原位毒力和宿主-病原体相互作用。最近，Jiang 等人进一步证实了 S. mutans 作为模型生物的作用，其具有产酸和耐酸适应策略，改变局部 pH 并选择耐药群落。来自口腔-全身疾病研究的额外宏蛋白质组学证据同样强调了 S. mutans 在复杂微生物网络中的功能相关性。然而，调节其生长动态和毒力调节的具体机制仍有待阐明。
   其他关键的口腔病原体包括牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）和具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum），除了在牙周病发病机制中起决定性作用外，还与全身疾病和肿瘤相关过程有关。例如，F. nucleatum 模拟口腔生物膜的代谢微环境，产生增加 P. gingivalis 毒力的代谢物，在这种增强的微环境中 P. gingivalis 改变口腔上皮细胞的自噬，有利于口腔鳞状细胞癌（OSCC）的进展。然而，尽管这些关联得到许多研究的支持，它们的因果作用仍有争议，需要进一步的功能验证。
   除了公认的口腔病原体外，机会性物种如鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）在口腔 microbiome 中日益被认识，特别是在生态失调状态和易感患者群体中。尽管其在口腔中的存在特征不太广泛，但其形成生物膜、在恶劣环境中持续存在和发展多重耐药的能力表明，它可能作为口腔生态位中抗菌耐药的储存库。新兴研究还表明与口腔炎症过程微环境改变的潜在联系，尽管这些关联仍是初步的。在分子水平上，群体感应系统如 abaR/abaL 调节毒力和生物膜形成，最近基于代谢组学的研究已开始探索与这些途径相关的小分子库。然而，大多数可用证据来自基因组和体外研究，强调了需要整合方法，特别是基于 LC-MS 的工作流，以将耐药决定因素与复杂生物膜环境中的功能代谢活性联系起来。
   这些关键物种之间的合作和竞争相互作用有助于代谢微环境的形成、抗菌耐药基因的交换以及参与生态失调和疾病进展的生物活性代谢物的产生。这些特征共同强调，口腔抗菌发现不能依赖简化的单一培养系统，而需要能够捕获多物种和动态代谢物介导的相互作用的分析策略。基于 LC-MS 的平台能够在蛋白质组和代谢组水平表征这些相互作用，支持生物标志物、代谢脆弱性和新抗菌候选物的鉴定。

3.1. 现代口腔抗菌发现管线中的分析技术

先进分析技术的整合深刻改变了现代抗菌发现管线，使我们能够系统地探索微生物群落的代谢空间，并理解表征复杂生态系统（如口腔生物膜）的化学相互作用。在此背景下，基于 LC-MS 的非靶向代谢组学是鉴定生物活性代谢物的最强大工具之一，即使在没有关于其结构或功能的初步信息的情况下。这种方法在研究口腔 microbiome 中特别相关，其中多物种相互作用产生相当大的代谢和功能多样性。

LC-MS/MS 和 LC-HRMS 平台可应用于蛋白质组学、代谢组学和脂质组学工作流，提供口腔生物膜内化学微环境的综合视图。

检测到的分子特征包括宿主衍生和 microbiome 衍生的分子。在本综述背景下，特别强调微生物衍生的代谢物和蛋白质，因为它们作为新型抗菌化合物和治疗靶点的潜在来源，而宿主衍生的分子主要作为生物标志物和宿主-微生物组相互作用的指标进行讨论。

唾液蛋白质组学的高深度开创性研究已证明 LC-MS/MS 表征数千种人类和微生物蛋白质的能力，为后续研究建立了重要的方法学参考。随后，整合的多组学方法显示了代谢和蛋白质特征如何反映口腔 microbiome 的功能状态及其与宿主的相互作用。这一视角得到了最近综述的进一步支持，这些综述强调了基于 MS 的分析在非侵入性生物流体中的诊断潜力，以及挥发性组学对复杂疾病生物标志物发现的更广泛贡献。

唾液成为具有巨大诊断和生物学意义的基质，因为它动态反映 microbiome 的代谢活性和宿主的生理反应。

Gardner 等人提供了唾液代谢组学最新技术水平的全面方法概述，强调了 LC-MS 和 NMR 在鉴定与口腔和全身状况相关的生物标志物中的核心作用。然而，作者也指出了重要的方法学关键问题，包括收集方案的异质性、分析前变异性和微生物组学与代谢组学数据整合有限。

沿着这些路线，Teruya 等人应用非靶向 LC-MS 方法研究口腔衰老，鉴定出参与糖酵解、氨基酸代谢和磷酸戊糖途径的代谢物显著改变。结果表明口腔代谢功能随年龄协调下降，但有限的样本量和地理同质性降低了结论的普遍性。

类似地，Grocholska 等人提供了关于质谱应用于唾液的全面方法学综述，批判性地描述了工作流、样品制备策略和主要分析局限性。

最近，Ciurli 等人引入了口腔代谢组的创新时空映射方法，证明口腔不同区域呈现独特且动态的代谢谱。这种方法超越了“平均唾液”的概念，允许更真实地表示口腔的生态异质性。然而，采样的复杂性和高生物变异性仍然使这些方法的标准化和临床转化困难。

LC–MS 分析的功能重要性在致力于多物种生物膜内代谢相互作用的研究中清晰显现。Sakanaka 等人证明 F. nucleatum 作为中心代谢节点，将来自共生物种的底物转化为能够调节 P. gingivalis 毒力的生物活性代谢物。这些结果支持代谢交叉喂养作为生物膜恢复力及其适应抗菌胁迫能力的基本决定因素的概念。同时，宏蛋白质组学研究表明，改变的蛋白水解和代谢活动与生态失调状态（如牙侵蚀和牙周病进展）相关。

LC–MS 技术的另一个主要贡献是探索口腔 microbiome 的“隐秘化学空间”。Edlund 等人表明，许多生物活性代谢物专门在多物种环境中产生，在传统单克隆培养中不存在。这一范式显著扩展了抗菌发现的景观，突出了口腔 microbiome 作为新型生物活性分子来源的潜力。然而，这些代谢物的结构鉴定、分离和功能验证仍然是复杂的过程，仍然是发现管线的主要瓶颈之一。

同时，基于 LC-MS 的蛋白质组学在鉴定与口腔和全身疾病相关的唾液生物标志物方面获得了越来越大的相关性。最近的系统综述表明，这些平台允许鉴定差异表达蛋白质并将其与特定疾病状态相关联。然而，重要挑战仍然存在，包括采样方案的异质性、小样本量、缺乏独立验证队列以及生物信息学管线的变异性。即使像 QUADAOMICS 这样的方法框架，它整合了宏基因组学、宏转录组学、宏蛋白质组学和代谢组学层以改善组学研究的评估质量，也不能消除偏倚风险和结果过度解释。

该领域的最新进展涉及 LC-MS 和 IMS 技术的整合，为代谢组分析引入了空间维度。与传统提取方法不同，这些技术允许直接可视化代谢物在生物膜三维基质内的分布，保留微生物相互作用的生态背景。尽管灵敏度和定量仍低于传统 LC-MS，但 IMS 允许鉴定位于特定微环境中的代谢物，这些微环境以营养梯度、氧气和环境胁迫为特征。

另外，基于 IM–MS 的方法通过 CCS 测量增加了额外的结构分离层，改善了异构体物种的区分并支持分子鉴定。Paglia 和 Astarita 描述的原理已被应用，例如，在 Vaysse 等人的研究中，其中通过快速蒸发电离质谱（REIMS）获得的脂质谱用于区分口腔的肿瘤和健组织。

来自 IMS 的空间数据与通过 LC-MS 获得的组学数据的整合正在逐步重新定义临床现实条件下口腔生物膜的研究。研究表明，这种方法允许鉴定与糖尿病、口腔炎症和牙周炎相关的分子特征，突出了生物膜空间组织与疾病状态之间的密切关系。此外，这些方法允许我们监测抗生素和抗菌剂在细胞外基质内的分布，突出显示浮游模型中没有出现的有限渗透和局部耐药现象。

总体而言，基于 LC-MS 的技术是理解口腔化学和生态复杂性的基本工具。代谢组学、蛋白质组学、脂质组学和空间成像的整合现在使代谢产生、生物膜组织和微生物适应的直接整合成为可能，为鉴定生物标志物、代谢脆弱性和创新抗菌化合物开辟了新视角。尽管取得了重大进展，但与工作流标准化、未知代谢物注释和结果的生物学验证相关的关键挑战仍然存在，这些方面对于将这些技术转化为抗菌发现和精准口腔医学中真正适用的工具至关重要。此外，有效的多组学整合取决于强大的数据处理策略，包括批次效应校正、信号漂移调整、归一化和特征对齐程序。机器学习（machine-learning）和基于人工智能（AI）的方法在降维、特征选择和预测建模方面的日益使用进一步支持将代谢组和蛋白质组数据集整合为连贯的生物学解释。

3.2. 通过基于 MS 的方法鉴定的代表性口腔 Microbiome 衍生分子

通过基于 MS 的方法鉴定的生物活性代谢物和生物标志物的代表性示例总结在表 3 中。

分析平台突出了代谢脆弱性，各类生物活性分子的生态信号可能与未来的抗菌发现相关。表 4 总结了与发现相关的生物学相关性和分析技术。

最近的基于 MS 的研究表明，口腔 microbiome 不仅是抗菌耐药的储存库，也是具有治疗活性的生物活性代谢物的来源。多物种生物膜已被证明产生隐秘代谢物和代谢相互作用网络，这些在单一培养系统中无法检测到。这些发现突出了口腔 microbiome 衍生分子作为候选抗菌或抗生物膜剂的转化潜力。通过基于 MS 的方法鉴定的代表性示例总结在表 5 中。

总体而言，这些发现突出了口腔 microbiome 衍生代谢物的转化潜力，并支持将基于 MS 的多组学方法整合到未来的抗菌发现管线中。

3.3. 抗菌代谢物的功能优先化

除了鉴定新型代谢物外，抗菌发现管线中同样重要的步骤是其生物活性的功能表征。结构注释本身不足以优先化用于药物开发的化合物，因此阐明其作用机制（MoA）是发现过程的关键组成部分。在口腔 microbiome 中，基于 MS 的代谢组学揭示了通过多种机制干扰细菌生理学的代谢物，包括破坏生物膜形成、调节群体感应、代谢竞争、抑制毒力相关途径和直接抗菌活性。从生化角度来看，这些代谢物通过不同的作用机制发挥抗菌作用。一些通过破坏膜完整性、损害细胞壁生物合成或干扰蛋白质和核酸合成直接抑制细菌生长。其他主要通过抗毒力机制起作用，包括抑制群体感应、抑制细胞外聚合物物质（EPS）产生、破坏生物膜成熟、干扰病原体持续所需的代谢途径或螯合必需营养素如铁。越来越多的证据表明，许多口腔衍生的代谢物减弱细菌适应性和生态竞争力，而不是直接导致细胞死亡，从而减少了对抗菌耐药的选择压力，同时保留了常驻 microbiota 的整体平衡。这种生态作用模式对于口腔抗菌发现特别有吸引力，因为它靶向生态失调生物膜的功能组织，而不是不加选择地消除微生物群。Sakanaka 等人描述的代谢交叉喂养说明了代谢物如多胺和短链脂肪酸如何通过种间代谢相互作用调节 P. gingivalis 的生理学和毒力，而不是直接杀死。类似地，Cleaver 等人的工作鉴定了与口腔生态失调相关的改变蛋白水解活动，突出了可能代表新型抗菌靶点的酶途径。这些例子表明，基于 MS 的发现越来越多地鉴定多物种生物膜内的生态脆弱性，将抗菌活性的概念扩展到单纯的生长抑制之外。因此，整合代谢物鉴定与功能分析、作用机制研究和生物膜验证已成为优先化抗菌先导物、减少假阳性候选物和改善基于 MS 的指导发现管线的转化潜力的基本步骤。

1. 4.
   口腔抗菌发现的未来整合管线
   空间代谢组学、多组学整合、先进质谱和计算分析的融合正在逐步重塑口腔中的抗菌发现。基于本综述中讨论的证据，图 4 展示了一个未来整合的抗菌发现管线，强调了微生物生态学、先进分析平台、生物信息学和转化应用之间的相互作用。
   总的来说，所综述的研究表明，从还原论的抗菌发现策略逐步过渡到整合的、生态学驱动的工作流，更好地反映了口腔 microbiome 的生物学复杂性。通过结合分析深度、空间分辨率、功能多组学和计算预测，这些方法有可能改善靶点优先化，加速生物活性分子的鉴定，并促进实验室发现转化为临床相关的口腔传染病治疗策略。
2. 5.
   结论
   新抗菌药物的发现仍然是应对抗菌耐药的全球响应中最紧迫的优先事项之一。本文综述的证据表明，口腔远不止是一个感染部位：它代表了一个高度动态的微生物生态系统，其中复杂的生态相互作用、专门代谢和抗菌耐药共存。这些特征使口腔 microbiome 成为探索新型抗菌靶点和先前未认识的生物活性分子的独特环境。
   质谱、代谢组学、蛋白质组学、成像技术和多组学整合的最新进展极大地扩展了研究这种复杂性的能力。通过连接微生物组成与代谢功能、空间组织和生物膜活性，这些分析方法提供了对口腔微生物生态学的系统水平理解，这是传统基于培养的策略无法单独实现的。然而，仍然存在重要挑战，包括工作流标准化、代谢物注释、功能验证以及将分析发现转化为临床相关的抗菌候选物。重要的是，代谢物的鉴定并不一定意味着生物学相关性或治疗潜力。弥合分子注释和生物学验证之间的差距仍然是基于 MS 的抗菌发现的主要瓶颈之一。此外，许多当前的组学研究仍然主要是关联性的，强调需要功能研究来建立微生物代谢物、生态相互作用和抗菌活性之间的因果关系。
   为了更清晰地综合本综述中讨论的三个主要应用方向，主要结论可总结如下：
   （i）抗菌分子发现。
   先进的基于 MS 的代谢组学和蛋白质组学能够鉴定化学多样化的生物活性代谢物、代谢脆弱性和可利用的生态相互作用，用于下一代抗菌剂。口腔 microbiome 成为与抗菌创新相关的新分子支架和适应性途径的储存库。这些发现支持了对生态失调生物膜生态调节作为传统广谱抗菌治疗补充策略的日益关注。
   （ii）监测抗菌耐药。
   蛋白质组和代谢组学特征支持耐药决定因素、ARG 转移和生物膜相关表型的检测。基于 MS 的工作流提供了敏感工具，用于跟踪复杂口腔群落中抗菌耐药的出现、传播和功能表达。
   （iii）疾病诊断和临床分层。
   高分辨率分析平台有助于表征与生态失调、炎症和生物膜活性相关的诊断生物标志物。整合空间代谢组学、成像 MS 和多组学数据增强了区分疾病状态和识别临床有意义分子模式的能力。
   总体而言，综述的文献表明，先进分析方法学的演变正逐步将抗菌发现转变为一个整合的、生态学驱动的过程。口腔 microbiome 不应仅被视为抗菌耐药的储存库，还应被视为化学多样化和生物活性分子的宝贵来源。使用先进的基于 MS 的分析平台、现实的生物膜模型和计算方法系统探索这一生态系统，可以加速下一代抗菌剂的发现，不仅用于治疗口腔传染病，而且作为对抗抗菌耐药的更广泛创新治疗来源。
   本综述有几个局限性。首先，文献覆盖必然是选择性的，反映了在口腔 microbiome 研究中采用基于 MS 方法的研究的可用性；新兴技术如单细胞质谱、天然 MS 或超高通量代谢组学未被包括，因为它们在口腔生态系统中的应用仍然有限。其次，讨论的大多数证据来自体外或早期研究，这些发现向临床环境的转化仍在进行中。此外，研究间相当大的方法学异质性，包括采样策略、生物膜模型、提取方案和生物信息学工作流的差异，限制了可重复性并阻碍了跨研究结果的直接比较。最后，分析平台和计算工具的快速发展意味着一些方法学进展可能尚未完全代表。这些局限性强调了需要持续的方法学发展和在 future 研究中更广泛地整合下一代 MS 技术。未来的进展将不仅取决于持续的技术创新，还取决于标准化分析工作流、全面的微生物谱库、实验验证的生物膜模型和能够将分子发现转化为临床有用抗菌疗法的跨学科策略的发展。