综述：人类眼睛中长寿命蛋白质的构象漂变：对翻译后修饰及眼部蛋白质老化分析技术的探讨

《Ageing Research Reviews》：Conformational Drift of Long-Lived Proteins in the Human Eye: Insights into Post-Translational Modifications and Analytical Techniques for Ocular Protein Ageing

　　摘要：长期存在的蛋白质为研究人类衰老的分子化学机制提供了独特的研究素材，而眼睛则是观察这一过程的最为便捷且空间分辨率较高的系统之一。晶状体是最主要的模型：其中央的晶状体蛋白在胚胎期及出生后早期合成，并在整个生命周期内保留下来，从而记录下了不可逆的化学损伤的累积过程。我们还将这一框架扩展到其他含有长期存在或更新缓慢的蛋白质的眼部结构，包括布鲁赫膜、晶状体囊膜与膜蛋白组、小梁网以及角膜基质，这些结构中的结构蛋白和细胞外基质的累积化学损伤同样可能影响组织衰老及疾病易感性。随着年龄增长，这些蛋白质会经历大量的翻译后修饰，包括脱酰胺、异天冬氨酸形成、消旋、截断、氧化、二硫键重排、糖基化、氨甲酰化以及光化学加合物的形成，这些修饰逐渐改变它们的构象特征。在本综述中，我们认为这些修饰的渐进式累积效应构成了一种被称为“构象漂移”的过程：即蛋白质集合体在化学作用下从天然构象状态向异质性、不稳定的、难溶且易于聚集的状态转变。例如，在晶状体中，这一过程会破坏晶状体蛋白的排列，耗尽α-晶状体蛋白的伴侣蛋白储备，促进相分离和光散射，进而导致晶状体核的年龄相关硬化。最后，我们对目前用于追踪这些分子事件的分析策略进行了批判性评估，并认为人类眼睛是眼科之外用于研究衰老机制的未被充分利用的模型。

引言：活细胞的蛋白质组并非一成不变：在大多数哺乳动物细胞中，蛋白质稳态是通过持续的蛋白质合成、折叠、运输和降解来维持的，这样受损或错误折叠的蛋白质就能被伴侣蛋白识别并通过蛋白酶体和溶酶体途径被清除（Labbadia和Morimoto，2015；Mathieson等人，2018；Tundo等人，2020）。因此，许多细胞内蛋白质的半衰期为数小时到数天，而非数月或数年（Hipp等人，2019；Schwanh?usser等人，2011）。一个生物学上极为重要的例外就是长期存在的蛋白质，这类蛋白质能够持续存在数月、数年甚至数十年，其更新速度极慢或几乎可以忽略不计，它们存在于多种环境中（Toyama等人，2013；Toyama和Hetzer，2013），包括有丝分裂后神经元中的核孔蛋白、大脑中的组蛋白和髓鞘相关蛋白（Savas等人，2012）、胶原蛋白等细胞外基质蛋白（Verzijl等人，2000），尤其是人类晶状体中的晶状体蛋白（Lynnerup等人，2008；Truscott等人，2016）。长期存在的蛋白质必须在远远超过许多氨基酸侧链和肽键固有化学稳定性的时间尺度上保持功能；正因如此，它们极易受到逐步的翻译后修饰的影响，这些修饰包括累积的氧化损伤、糖基化、脱酰胺、消旋、截断、主链断裂，而在眼睛等暴露于外界的环境中，还可能遭受紫外线伤害（Lampi等人，2014a；Truscott，2011；Truscott和Zhu，2010；Verzijl等人，2000）。这使得长期存在的蛋白质成为衰老生物学研究的核心，表明蛋白质稳态的下降是衰老的关键特征，同时也支持了这样一种观点，即化学损伤且易于聚集的蛋白质的积累会直接导致与年龄相关的组织功能障碍（Hipp等人，2019；Labbadia和Morimoto，2015；López-Otín等人，2023）。

在这一框架下，人类眼睛，尤其是晶状体，是研究人类正常组织中蛋白质衰老的极佳模型，因为其内部的晶状体蛋白在胚胎期及出生后早期合成，之后会终生保留（Bassnett，2009；Lynnerup等人，2008；Schey等人，2020；Truscott和Zhu，2010）。晶状体边缘的持续生长形成了从年轻皮质到老化核部的蛋白质年龄梯度，这使得能够对整个生命周期内的累积翻译后修饰进行区域性的生化分析（Augusteyn，2010；Hains和Truscott，2007a；Hains和Truscott，2010；Schey等人，2020）。此外，眼部组织相对容易进行跨不同年龄段的直接生化和蛋白质组学分析，而且终生分子退化的功能效应十分明显，表现为白内障以及与老花眼相关的老化硬化、全盲和视力障碍（Burd等人，2011；Steinmetz等人，2021；Truscott和Zhu，2010；Weeber等人，2007）。

除了可溶性的晶状体蛋白之外，眼睛中的蛋白质长寿还体现在对组织稳态至关重要的膜结构和细胞外结构中。在晶状体中，成熟的纤维细胞膜依靠大量且长期存在的蛋白质，如水通道蛋白AQP0以及缝隙连接蛋白Cx46/Cx50，来维持内部的微循环系统，而晶状体特有的珠状丝状蛋白则有助于保持纤维细胞的结构与生物力学特性（Gutierrez等人，2011；Mathias等人，2007；Schey等人，2017；Slavi等人，2014；Z. Wang等人，2010）。这些成分也会随着年龄增长而发生累积的翻译后重塑，这表明膜运输、细胞间连接以及细胞骨架的完整性都在整个生命周期中逐渐发生变化。同样的逻辑也适用于眼部细胞外基质，尤其是晶状体囊膜和布鲁赫膜，由于它们的更新速度缓慢，随着年龄增长容易出现糖基化、交联、脂质沉积以及通透性变化（Booij等人，2010；Danysh和Duncan，2009；Moore和Clover，2001）。

综合来看，这些系统将长期存在的蛋白质的概念从单纯的可溶性蛋白质存活问题，拓展为衰老眼睛中膜结构组织和基质功能的长期维持问题。因此，长期存在的蛋白质可以充当分子时钟，因为逐渐累积的化学变化，如天冬氨酸的消旋和异构化，能够记录下蛋白质的存在时间以及组织的历史（Lynnerup等人，2008；Ritz-Timme和Collins，2002；Robinson和Robinson，2001）。这种更广阔的视角对于理解终生分子损伤如何不仅导致白内障，还会引发生物力学改变、氧化还原稳态紊乱以及视网膜疾病至关重要。

本综述的核心概念是“构象漂移”：即蛋白质群体在化学作用下从天然构象逐渐向异质性、改变且功能受损的状态转变。我们特意选择“漂移”而非“错误折叠”或“变性”，是为了强调这一过程的几个关键特征：其一，它是渐进且累积的，而非一次性的折叠事件；其二，它是由化学因素驱动的，而非主要由突变或折叠错误引起；其三，它是异质性的，同一衰老组织中的不同分子会积累不同的翻译后修饰组合，从而形成更为多样化的蛋白质集合体，而非单一的错误折叠状态；其四，这一过程会因环境因素而加剧：衰老晶状体的物理化学微环境，包括离子强度升高、谷胱甘肽水平下降、水分含量变化、蛋白质浓度上升以及伴侣蛋白能力减弱，都会共同加速并显现出翻译后修饰累积带来的结构效应。重要的是，这一过程并不一定涉及蛋白质的广泛展开或天然晶状体折叠结构的丧失；在某些晶状体系统中，易于聚集的蛋白质仍保持着类似天然的总体折叠结构，其病理变化则表现为构象动态改变、局部展开、表面区域暴露、结构域界面不稳定、氧化还原陷阱形成或自我结合能力增强（Boatz等人，2017；Serebryany等人，2016；Serebryany等人，2020；Volz等人，2025）。

因此，构象漂移代表了将累积的化学修饰与可见的物质缺陷联系起来的核心驱动机制与中间环节（见图1）。翻译后修饰作为分子触发因子，会引发后续效应，如蛋白质不溶化、聚集、光散射以及硬化。随着时间推移，不可逆的翻译后修饰、蛋白质形态变异、氧化还原失衡、蛋白质过度聚集以及伴侣蛋白供应减少，都会使眼部长期存在的蛋白质从天然的、可溶性的状态转变为异质性、不稳定的且易于聚集的状态。

章节概要与概念差异：人类眼睛中的长期存在蛋白质可大致分为两类，它们在生物学背景、物理化学环境以及损伤累积机制方面存在差异。细胞内的长期存在蛋白质存在于长期存活或已完全分化的细胞中，这些细胞中的蛋白质更新速度很慢，有些情况下，负责蛋白质合成和质量控制的细胞机制也显著减弱。晶状体纤维细胞中的晶状体蛋白就是此类蛋白质的典型代表。

眼睛蛋白质衰老的化学机制：驱动构象漂移的翻译后修饰：在人类的一生中，晶状体晶状体蛋白及其他眼部长期存在蛋白质上积累的化学修饰，为研究蛋白质的累积损伤提供了人类生物学领域中最详尽的分子证据之一。人类晶状体具有极高的研究价值，因为其中央蛋白质在几乎不会更新的细胞环境中能持续存在数十年，这使得蛋白质侧链和主链的化学变化能够产生重要的生物学后果。本部分将逐一探讨各类主要的翻译后修饰。

晶状体中构象漂移的结构生物物理学：如果翻译后修饰发生在暴露在溶剂中且较为灵活的位点，使用低分辨率分析方法可能检测不到或只能检测到极微小的结构变化。但这并不意味着它在功能上毫无意义。即便只是轻微的不稳定，也可能显著改变蛋白质的天然状态与部分展开状态之间的平衡，尤其是在晶状体核部（Hains & Truscott，2007b）。该区域晶状体蛋白浓度极高，因此哪怕是微小的能量扰动也会因蛋白质过度聚集而被放大。

眼睛衰老中的蛋白质稳态限制：蛋白质稳态是一个由伴侣蛋白辅助的折叠、解聚、泛素-蛋白酶体降解（Grasso等人，2015；Grasso，2019；Zingale等人，2025）以及自噬等过程构成的复杂网络，它在大多数衰老组织中的功能会逐渐下降，但在整个生命过程中仍能保持至少部分功能（Hipp等人，2019；Labbadia和Morimoto，2015）。然而，人类晶状体核的情况则截然不同：在纤维细胞完全分化之后，晶状体会失去……

疾病相关性：从分子衰老到临床表型：翻译后修饰的累积、构象漂移与眼部临床疾病之间的关系，更适合用一个逐步强化的证据谱系来描述，而非简单的因果二元关系。当分子变化与受影响的组织结构共定位、随年龄和疾病严重程度而变化，并且与光散射、硬化或基质运输功能障碍等已知的生物物理机制相吻合时，就能得出最有力的推断（Truscott，2005；Truscott和Friedrich，2019）。

眼部蛋白质衰老的分析方法：本部分是本综述最具实用价值的贡献之一。我们系统地评估了用于分析眼部长期存在蛋白质的翻译后修饰及构象变化的各类分析方法（见表2），同时重点分析了这些方法的实际能力、局限性、缺陷以及常见的误读情况。

减缓构象漂移的干预策略：现有证据与转化应用局限：在延缓眼睛衰老方面，最具理论依据的干预措施仍是氧化还原调节，因为与年龄相关的白内障与氧化应激、核内谷胱甘肽含量下降以及向晶状体中心输送还原物质的能力减弱密切相关（B. Lee等人，2024）。Cx46介导的缝隙连接转运有助于谷胱甘肽向晶状体核部的输送，而衰老的人体晶状体纤维会丢失大量Cx46/Cx50蛋白（Slavi等人，2014）。在人工诱导的白内障模型中……

结论：人类晶状体为研究长期存在蛋白质的化学特性提供了一个极为特殊的自然实验样本：这是一种经过进化选择而允许化学损伤不断累积的组织，但它却能保持极高的光学清晰度，而且这种损伤所带来的逐步后果，包括构象漂移、蛋白质聚集以及机械硬化，都可通过可测量、可定位的化学指标来反映，理论上也可对其进行调控。本综述所定义的构象漂移并非……

未引用参考文献：Cournoyer等人，2006；Derham和Harding，1999；Finley等人，1998b；Lee和O’Reilly，2023；《晶状体生物学与生物化学》，2015；匿名作者，2001；Y?lmaz等人，2018

利益冲突声明：作者声明自己没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。

致谢：本文的研究得到了意大利卫生部（当前研究项目）以及罗马基金会的大力资助。此外，该研究还获得了HORIZON-EIC-2024-PATHFINDEROPEN-01项目资助，项目编号为101185661——ERMES。“2024/2026年度大学研究激励计划（Pia.ce.ri.）”，卡塔尼亚大学也对此给予了支持。

Damiano Calcagno | Diego Sbardella | Mariacristina Parravano | Nunzio Tuccitto | Giuseppe Grasso
IRCCS-Fondazione Bietti，意大利罗马