综述：用于评估mRNA加帽效率的分析方法——全面综述

《Analytica Chimica Acta》：Analytical methods for estimation of the mRNA capping efficiency - A comprehensive review

　　摘要：mRNA治疗药物的帽化效率是其关键的质量属性，但对其准确评估仍是一项复杂的分析任务。由于长度达数百至数千个核苷酸的mRNA中，帽结构对整体分子量的贡献极小，因此要区分带帽与无帽的mRNA需要多步骤的样品制备以及高灵敏度的分析仪器。此外，转录、帽化及后续分析过程中可能出现的5′端异质性也会增加分析难度。本文全面概述了目前用于定量评估mRNA帽化效率及帽成分分析的各种方法，同时探讨了方法学研究中发现的5′端异质性的来源。该综述有助于研究人员根据自身研究目标及mRNA治疗药物的开发阶段，选择最合适的评估策略。

引言：基于mRNA的药物为多种疾病的治疗和预防提供了新途径，近年来其生产技术的研发进展迅速[1]。mRNA技术领域的进一步发展离不开能够确保质量控制的分析方法。决定合成mRNA模板安全性和功能特性的重要指标之一就是帽化效率，它指的是具有正确5′端帽结构的mRNA分子的比例。这一指标被列为关键质量属性（CQA），并与3′端poly(A)尾的长度及异质性一同被纳入美国药典指南中[2]。5′端帽是由N7-甲基鸟苷通过5′-5′三磷酸桥与转录本的首个核苷酸相连而成的结构（见图1）。这种结构存在于典型的线性非复制型mRNA以及具有自我扩增功能的创新RNA中[3]，还可被引入环状RNA中以提高翻译效率[4][5]。在模拟真核生物内源性mRNA的5′端帽时，第一个核苷酸，有时还有第二个靠近帽端的核苷酸的核糖2′-O位点会被甲基化，从而形成cap-1和cap-2结构（见图1）。未经过此类修饰的结构被称为cap-0，在治疗和生物技术应用中通常避免使用[6][7][8]。5′端帽可以在体外转录过程中通过合成帽类似物实现（共转录帽化），也可以在mRNA合成之后利用重组病毒衍生的帽化酶实现（转录后帽化）[9]。此外还有化学帽化方法，例如在铜催化下进行叠氮化物-炔烃环加成反应[10]，或是通过在二甲亚砜有机溶剂中让5′-磷酸化寡核苷酸与Im-m7GDP发生反应来实现帽化[11]。这些方法的帽化效率不同，且会导致产生的无帽mRNA的5′端结构也存在差异。共转录帽化被认为是最快的方法，此时会将含有N7-甲基鸟苷帽以及一个或两个可带有不同化学取代基的靠近帽端核苷酸的合成类似物加入体外转录混合物中[6]。那些底物特异性较低的RNA聚合酶（如T7和SP6 RNA聚合酶）能够利用这类类似物作为起始核苷酸；但由于核糖上存在3′-OH，第一代m7G衍生的二核苷酸类似物（如m7GpppG）可能会以反向方向掺入转录本中。为解决这一问题，人们使用了对称性类似物（如m7Gpppm7G），以及后续开发出的抗反向帽类似物（ARCA）[12]和三核苷酸类似物（CleanCap）。二核苷酸类似物只能生成cap-0结构，而三核苷酸类似物则能形成cap-1结构。在这种情况下，三核苷酸不仅作为起始核苷酸，还因与DNA模板链+1和+2位置互补而充当引物[13]，从而确保正确的方向和高嵌入效率（超过98%）。然而，由于在合成开始时帽类似物与起始核苷酸-5′-三磷酸（iNTP）之间存在竞争，无法实现100%的RNA帽化。当iNTP被掺入时，就会产生带有未反应三磷酸在5′端的无帽杂质。帽化RNA的产率会因体外转录条件的不同而有很大差异，这些条件包括帽类似物的类型、帽类似物与iNTP的比例、RNA聚合酶的类型以及转录起始序列等[14][15][16][17]。酶法帽化是在RNA合成之后的单独步骤，除了使用帽化酶外，还可能需要用2′-O-甲基转移酶处理，以获得cap-1结构。使用牛痘病毒帽化酶（VCE）通常能生成88–98%的cap-0结构RNA（在S-腺苷甲硫氨酸浓度足够高的情况下，N7甲基化程度可达约99%），而若加入2′-O-甲基转移酶，则可得到约95%的cap-1结构RNA[18][19]。另有研究显示，VCE还能在RNA的5′端引入各种修饰后的GTP类似物[20]。不过这种方法存在需要额外纯化RNA的缺点，而且还可能生成作为帽化中间产物的异常5′端结构（GpppN）。RNA 5′端区域的异常变化会被先天免疫系统识别，同时也可能影响mRNA的翻译性能。未被帽化的5′-三磷酸化mRNA、N7位点未被甲基化的mRNA（G帽结构）以及cap-0结构的转录本可以被IFIT家族蛋白（IFIT1和IFIT5）识别[21][22][23]。在双链RNA副产物中，这些相同的5′端结构也会作为视黄酸诱导基因1（RIG-I）的配体[24][25][26]。在哺乳动物细胞中，未被帽化的RNA几乎无法被翻译，而且N7甲基化的缺失会显著降低eIF4E对帽类似物的亲和力[27]，此类RNA的翻译效率也极低[28][29]。鉴于5′端帽对mRNA功能的重要性，必须确认其连接反应是否成功。然而，评估帽化程度并非易事。N7-甲基鸟苷的质量与单个核糖核苷酸相当，而对于长度较长的分子来说，这一质量已超出大多数分析方法的检测极限。此外，随着RNA长度的增加，单位质量内的5′端结构数量相对减少，这就需要要么增加用于分析的RNA量，要么通过额外的样品制备步骤来富集5′端结构，从而提高分析方法的灵敏度。体外合成的mRNA中5′端结构种类繁多，这可能会带来意想不到的复杂性，其结构并不只是简单分为带帽与无帽两类。除了因帽化方法不同而产生的异常帽化mRNA外，样品中还可能存在因5′端核苷酸的增减而形成的其他转录变体[30]。此外，还可能存在帽结构降解产物，它们属于另一类杂质[31]。5′端结构的多样性会降低mRNA的功能活性，同时也会给需要高样品均匀性的RNA结构研究带来困难，比如使用核磁共振或X射线晶体学进行研究时[32]。迄今为止，由于分析5′端RNA结构的方法学挑战，5′端异质性对mRNA治疗药物的有效性与安全性影响的了解仍然十分有限。此前已有不少综述文章讨论过评估帽化效率的方法[33][34][35]，但在过去两年中，相关方法学研究大幅增加，人们对分析这一mRNA质量参数的兴趣也在不断提升。据我们所知，目前还没有任何综述文章深入探讨5′端异质性问题，而仅停留在将其简单分为带帽与无帽转录本的基础上。本文则提供了关于RNA帽化分析方法的最新且全面的概述，分析了RNA 5′端结构的可能变异形式，并重点探讨了分析方法在定量和定性表征这些结构方面的能力。同时，我们还介绍了更深入分析5′端帽的方法，包括确定其方向、脱帽效率以及分析细胞内的帽结构。

章节节选：
异质性RNA 5′端亚型的形成机制
在选择评估帽化效率的方法时，需考虑是否存在其他5′端mRNA结构变异，因为这些变异可能会使结果解读变得复杂。本节将探讨体外转录过程以及后续样品制备和帽化分析阶段中，mRNA 5′端异质性的主要来源。

基于完整RNA的分析方法
与自下而上的分析策略相比，基于完整RNA的定量分析方法所需的样品制备工作更少，从而降低了RNA降解的风险，也能减少帽化与无帽转录本比例被改变的可能性。目前的基于完整RNA的分析方法主要是通过对带帽与无帽RNA组分进行差异标记，再对其进行定量分析。这类方法主要用于检测带帽RNA，无法用于确定5′端信息。

用于分析细胞mRNA帽结构的广谱检测方法
本节介绍了用于系统分析细胞转录本5′端帽结构的现代方法，包括用于定量分析帽表观转录组的LC–MS/MS方法，以及展现其在细胞环境中分析mRNA潜力的纳米孔测序技术。在分析导入细胞中的异源mRNA时，广谱检测方法有助于评估目标帽结构的稳定性，同时还能……

结论
评估帽化水平是mRNA治疗药物研发过程中的关键环节。一个潜在的挑战在于，体外转录得到的mRNA的5′端结构多样性并不仅限于带帽与无帽分子之间的简单区分。除了因帽化方法不同而产生的中间帽结构外，样品中还可能存在其他变异形式。这些杂质包括帽结构降解产物……

展望
mRNA制造技术的快速发展正在改变用于评估帽化程度的分析方法的要求。早期研究主要侧重于量化整体帽化效率，但现在人们已经意识到，分析体外转录过程中产生的5′端结构多样性同样至关重要。这些分子变异的分布很大程度上取决于所采用的帽化策略。共转录帽化主要会产生……

CRediT作者贡献说明
Sofia Shtraus：撰写——初稿。Ivan Skvortsov：撰写——审阅与编辑、可视化。Dmitriy Yakshin：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化。Alisa Kukushkina-Zvezdova：撰写——初稿。Roman Ivanov：撰写——审阅与编辑、监督。Vasiliy Reshetnikov：撰写——审阅与编辑、监督。Alena Kozlova：撰写——初稿、可视化、概念设计。

AI使用声明
作者们使用了ChatGPT-5来提升文本的可读性和简洁性，同时使用了Claude（Fable 5）来协助核实表7中所列的分子质量数值。在使用这些AI工具之后，作者们对输出内容进行了仔细审阅和修改，并对最终发表的作品负全责。所有表格数据均经过独立核查，并由人工补充完善。

利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
本研究得到了“天狼星”联邦行政区“天狼星联邦行政区科学和技术发展”国家计划项目的资助（协议编号3-03，签署日期为2025年2月18日）。Vasiliy Reshetnikov于2015年在新西伯利亚国立大学获得生物学专业学位，2019年在俄罗斯科学院西伯利亚分院细胞学与遗传学研究所完成研究生学习，并于2024年凭借神经科学领域的论文获得生物学副博士学位（相当于博士学位）。自2021年起，他一直在天狼星大学工作，目前担任RNA疫苗项目负责人。

Alena V. Kozlova | Dmitriy M. Yakshin | Alisa A. Kukushkina-Zvezdova | Sofia A. Shtraus | Ivan A. Skvortsov | Roman A. Ivanov | Vasiliy V. Reshetnikov
天狼星科技大学，俄罗斯天狼星联邦行政区奥林匹克大道1号，邮编354340