利用1H NMR技术进行天然丰度下的特定位置15N同位素分析

《Analytica Chimica Acta》：Position Specific 15N Isotope Analysis at Natural Abundance by 1H NMR

　　

摘要

对天然丰度下的氮元素进行稳定同位素分析，可为生化过程提供重要见解。然而，由于传统方法的灵敏度较低，对¹⁵N进行定位特异性同位素分析在技术上仍面临挑战。我们提出的方法依赖于在主导的¹H–¹⁴N三重峰中识别出嵌入其中的¹H–¹⁵N双峰，并在经过严格优化的定量核磁共振条件下通过光谱反卷积技术对其进行分析。以氯化铵为模型，我们确定了实现精确度（≤ 2‰）和准确度（< 3‰）所需的实验及处理参数，这些参数已通过同位素比率监测质谱法进行验证。该方法随后被成功应用于结构更为复杂的化合物（如苯胺、吲哚、尿素以及N-乙酰色氨酸甲酯），实现了精准的定位特异性δ¹⁵N测定。重要的是，我们还证明了将该策略应用于人类尿液样本的可行性，从而能够在天然丰度下直接测定复杂生物基质中内源性尿素的δ¹⁵N值。这种无损分析方法所需样本量极少，且能与同位素比率监测质谱法形成有效互补，进一步丰富了环境、生化及生物医学领域中氮同位素研究的分析手段。

引言

天然丰度下的氮元素稳定同位素分析是一种强大的工具，可用于揭示复杂系统中含氮化合物的来源及其转化路径。其应用范围包括食品和药品的真伪鉴定[1]、[2]、[3]，环境污染物的检测[4]、[5]、[6]，当代及历史饮食结构的重建[7]、[8]、[9]，以及用于确定生物样本的地理或生化来源的法医分析[10]、[11]。近年来，氮同位素比率还被视为疾病的潜在生物标志物，尤其是在肿瘤学领域，因为代谢变化会导致可测量的同位素偏移[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。

在大多数应用中，同位素比率是通过经验方式来解读的，即将其视为与特定来源或过程相关的独特特征或“指纹”。但实际上，这些同位素特征并非仅仅是描述性的，它们源自特定的（生物）化学机制。在生物系统中，氮同位素分馏主要源于键断裂和形成过程中的动力学同位素效应。这些效应会导致非统计性的分子内同位素分布，而在定位特异性层面这种差异尤为明显。这就凸显出需要采用稳健且精确的定位特异性同位素分析方法，这类方法能够提供通过质谱法进行的整体或化合物特异性同位素测量所无法获得的机制信息。

针对N₂O同位素体，人们已经对¹⁵N的定位特异性同位素分析进行了大量研究，尤其是通过测定其中心氮原子和末端氮原子的同位素组成[18]、[19]、[20]、[21]。不过，该方法在更大有机分子上的应用仍然十分有限。对于含有多个氮原子的有机化合物，要确定各个氮原子的位置，通常需要先通过选择性化学或酶解方法将分子分解，然后再对分离出的含氮产物进行质谱分析[22]。这类方法不仅工作量大，而且具有化合物特异性，对于那些体积较大、极性强或结构复杂的分子来说，还可能因为反应不完全、副反应或同位素分馏而影响位置信息的准确性。

另一种用于同位素测定的方法虽灵敏度较低，但也是核磁共振光谱技术，具体为核磁共振同位素比率监测法。这一技术最初是在20世纪80年代初为氘的定位特异性同位素分析而开发的[23]，大约15年后又被扩展到¹³C的同类分析[24]。基于核磁共振的定位特异性同位素分析方法在众多领域都得到了广泛应用，比如食品真伪鉴定[25]、[26]以及环境研究[27]、[28]。2019年，Joubert等人[29]开发了一种基于直接¹⁵N核磁共振光谱的¹⁵N定位特异性同位素分析方法。但由于¹⁵N的自然丰度极低（约为0.37%），仅为¹³C（约为1.1%）的三分之一左右，再加上其旋磁比（γ = -27.1· 10⁶ rad T^-1s^-1）远远小于¹H的旋磁比（γ = 267.5· 10⁶ rad T^-1s^-1），导致其灵敏度也相当低，因此通过直接¹⁵N核磁共振进行定位特异性同位素分析往往需要过大的样本量以及较长的采集时间。例如，对于浓度为700 mg/ml的1-甲基咪唑，每个光谱的采集时间可达3小时[10]、[29]。

上述两个限制因素使得该技术在应用上受到诸多制约，尤其是在生物医学领域，因为那里可用的样本量往往十分有限。不过，还是有一些方法可以克服这些限制。通过使用冷冻探针、极化转移序列[30]或先进的二维核磁共振技术，如绝热或对称异核单量子相干光谱技术[31]，可以提高分析的灵敏度。在这些方法中，磁化强度会从含量更丰富的¹H核转移到灵敏度较低的¹³C核上，从而显著缩短采集时间。借助这些方法，甚至只需5毫克的胆固醇样品就能对其进行¹³C定量分析[32]。不过，这类方法可能会引入δ¹³C值的偏差，因此只能用于相对比较，无法直接计算出具体的δ值[33]。

Hoffman和Rasmussen[34]最近提出了一种创新方法，他们发现，在适宜的条件下，可以通过整合由¹H-¹³C标量耦合产生的卫星峰与中心的¹H-¹²C信号相比，利用¹H核磁共振光谱来确定定位特异性的¹³C/¹²C比率。这种无需破坏样品的分析方法要求光谱具有较高的分辨率，目前已被应用于氨基酸及其他小型有机分子的研究中[35]、[36]。虽然他们的研究主要是针对¹³C，但这一基本原理——即检测¹H光谱中与不同同位素衍生物相关的细微结构——也可以应用于其他异核原子。

对于氮元素而言，¹⁵N（I=1/2）和¹⁴N（I=1）的核自旋特性会导致与其直接相连的质子呈现出不同的耦合模式：¹⁵N对应的质子呈现为双峰，而¹⁴N对应的质子则呈现为三重峰（见图1）。

在天然丰度条件下，¹H-¹⁵N信号表现为低强度的双峰，通常嵌入在强度更高的¹H-¹⁴N三重峰之中。通过整合这两个信号，就可以利用常规的¹H核磁共振光谱来实现¹⁵N的定位特异性同位素分析。

在本研究中，我们首先利用一系列模型化合物，如氯化铵、苯胺和吲哚，来探索并验证这一方法，之后又将其应用到色氨酸和尿素等具有生物学意义的分子上。在这里研究的绝大多数模型化合物中，要么只含有一个氮原子，要么像尿素那样含有两个化学性质相同的氮原子，因此所测得的同位素比率实际上代表的是整个分子的特性，而非严格意义上的定位特异性数据。尽管如此，这些化合物仍为验证基于¹H核磁共振的定位特异性同位素分析的方法论原理提供了有效的测试平台，而通过色氨酸衍生物则实现了真正的定位特异性测定。此外，由于尿素是氮元素排泄过程中的关键代谢物，对其进行分析也使得这种¹⁵N定位特异性同位素分析方法能够应用于尿液这类复杂的生物基质中。这为利用常规的¹H核磁共振仪器研究自然丰度条件下氮元素流动的代谢变化带来了新的可能性。

章节节选

样品材料

氯化铵（NH₄Cl）样品分别从VWR（编号NH₄Cl#1，批次22E254112）和Sigma Aldrich（编号NH₄Cl#2，批次SLCK6884）处购买。为了进行参考标准化及方法验证，我们还准备了不同¹⁵N富集程度的氯化铵样品，这些样品是通过将VWR提供的氯化铵与98%富集了¹⁵N的氯化铵（编号¹⁵NH₄Cl，来自Sigma Aldrich，批次MBBD3887）混合而成的。苯胺购自Acros Organic，编号为000089554；吲哚则从VWR购买，编号为A017496601。色氨酸衍生物Trp-OMe的编号为A10245，而Trp-OMe-NAC的编号则未在文中提及。

区分与¹⁴N结合的¹H与与¹⁵N结合的¹H

得益于质子与两种氮同位素之间不同的标量耦合模式，通过常规的¹H核磁共振光谱即可确定¹⁵N/$\sup>14$N同位素比率。由于¹⁵N的核自旋量子数为1/2，因此会形成双峰；而¹⁴N的核自旋量子数为1，因此在相同条件下会形成三重峰。除了峰形上的差异外，这两种核之间的耦合常数也有所不同，相应信号的强度也存在差异。由¹⁵N与质子之间的耦合所产生的双峰为

结论

本研究建立了一种概念验证型方法，证明在适宜的光谱条件下，利用¹H核磁共振光谱即可进行天然丰度下的¹⁵N同位素分析，而且其精确度、线性度和准确度都足以检测出分子内的同位素差异。通过利用质子与¹⁴N相比与¹⁵N之间的不同标量耦合模式，就可以通过光谱反卷积技术，直接从高分辨率且具备定量功能的¹H核磁共振光谱中确定¹⁵N/$\sup>14$N比率。

作者贡献说明

Maylis Couton：负责原文撰写——初稿撰写、实验研究、正式分析以及数据整理工作。Margot Sanchez：负责原文撰写——审阅与编辑、正式分析以及数据整理工作。Valérie Fargeas：负责原文撰写——审阅与编辑、研究指导、方法设计以及概念构思工作。Illa Tea：负责原文撰写——审阅与编辑、研究指导、方法设计以及概念构思工作。

备注

作者声明不存在任何可能的利益冲突。

数据获取情况

相关数据将在有需求时提供。

资金支持来源

本研究得到了法国国家研究机构（ANR）的资助（项目编号ANR-20-CE18-0020-0）。

利益冲突声明

? 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了法国国家研究机构的支持，具体是通过一项名为PRCE的研究项目为Illa Tea提供的资助（项目编号ANR-20-CE18-0020-03）。此外，本研究还得益于法国国家代谢组学与通量组学基础设施MetaboHUB-ANR-11-INBS-0010（网址为www.metabohub.fr）以及Biogenouest机构旗下的Corsaire代谢组学核心实验室的支持。本研究中的核磁共振实验是在CEISAM NMR、PLI CEISAM NMR以及CEISAM AMaCC平台上完成的。

Maylis Couton|Margot Sanchez|Valérie Fargeas|Illa Tea

法国南特大学、法国国家科学研究中心、CEISAM实验室、UMR 6230，地址：法国南特市，邮编44000