《Analytica Chimica Acta》：Small molecules dually targeting SARS-CoV-2 and host G-quadruplexes: binding mechanism explored by integrated experiments and computations
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摘要背景由SARS-CoV-2引发的新冠疫情持续对全球公共卫生构成重大挑战。针对G四重螺旋结构的小分子配体在抗病毒治疗中展现出巨大潜力。但目前的研究大多集中在单一病毒或孤立的宿主系统上，主要通过体外或体内实验来研究特定配体与特定G四重螺旋结构之间的相互作用。因此，亟需新的干预策略
摘要
背景
由SARS-CoV-2引发的新冠疫情持续对全球公共卫生构成重大挑战。针对G四重螺旋结构的小分子配体在抗病毒治疗中展现出巨大潜力。但目前的研究大多集中在单一病毒或孤立的宿主系统上，主要通过体外或体内实验来研究特定配体与特定G四重螺旋结构之间的相互作用。因此，亟需新的干预策略，并深入理解G四重螺旋与配体之间的相互作用机制，以推动合理药物设计的发展。
结果
本研究首次提出了一种双重靶向策略，同时作用于SARS-CoV-2病毒基因组中的G四重螺旋结构以及与病毒入侵相关的宿主基因（ACE2、AXL和TMPRSS2）。通过实验验证，这些靶标中的四个潜在G四重螺旋形成序列能够折叠成稳定的RNA G四重螺旋结构。我们综合运用光谱分析、等温滴定量热法以及分子动力学模拟技术，系统研究了三种小分子配体——berbamine（BBM）、TMPyP4（TMP）和topotecan（TPT）与这些G四重螺旋结构的结合情况。其中，TMP表现出更强的G四重螺旋稳定能力，其结合亲和力也远高于BBM和TPT。能量分解分析表明，TMP中带正电荷的吡啶基团所形成的强静电相互作用对于稳定结合至关重要。这些结果表明，在配体骨架中引入带电功能基团可提升其与G四重螺旋的结合亲和力。
意义
通过结合全面的实验表征和分子动力学模拟来研究双重靶向的G四重螺旋与配体相互作用，本研究为体外G四重螺旋与配体研究建立了系统化的方法体系，也为设计新的SARS-CoV-2治疗药物提供了重要依据。这一策略不仅对抗击新冠病毒具有巨大潜力，还可作为应对未来新出现的病毒威胁的有效方案。
引言
G四重螺旋是一种非经典的核酸二级结构，它是由富含连续重复鸟嘌呤序列的DNA或RNA中的G四联体通过Hoogsteen氢键堆叠而成[1]。G四重螺旋结构广泛存在于各种生物的基因组中，它们既参与基因表达调控，也在病毒生命周期中发挥关键作用。有研究显示，HIV-1长末端重复序列启动子中的G四重螺旋结构能够降低病毒转录水平[2]。宿主基因组中的G四重螺旋结构也会影响病毒的复制和入侵过程，进而决定病毒的感染力和致病性。鉴于其重要作用，研究表明小分子配体能够特异性地靶向G四重螺旋结构，从而为多种疾病的治疗提供潜在可能[3]、[4]、[5]、[6]。苯并硒杂蒽类化合物可通过稳定宿主跨膜丝氨酸蛋白酶2基因中的G四重螺旋结构，抑制甲型流感病毒的传播，进而降低该蛋白的表达水平[7]。因此，G四重螺旋结构已成为抗病毒研究中的重要潜在治疗靶点。
自2019年底爆发以来，由SARS-CoV-2病毒引发的新冠疫情已演变为一场全球性的公共卫生危机。SARS-CoV-2属于单链RNA病毒[8]。通过使用G4CatchAll、pqsfinder以及QGRS Mapper等生物信息学工具进行序列分析，人们在SARS-CoV-2基因组中发现了多个高度保守的潜在G四重螺旋形成序列[PQSs][9]、[10]、[11]、[12]、[13]。研究表明，N蛋白编码区域中的RG-1序列能够形成G四重螺旋结构。利用PDP稳定RG-1结构可以干扰核衣壳蛋白的翻译过程，从而降低病毒载量[14]。SARS-CoV-2感染还会涉及多种宿主细胞，其中血管紧张素转换酶2、AXL受体酪氨酸激酶以及TMPRSS2在病毒感染过程中起着重要作用[15]、[16]。刘等人发现，稳定TMPRSS2基因组中的G四重螺旋mRNA可以抑制该蛋白的翻译和表达，进而阻止SARS-CoV-2的复制[17]。这一发现以及其他相关研究都表明，RNA G四重螺旋结构在SARS-CoV-2的感染过程中发挥着重要作用[18]、[19]、[20]。因此，利用小分子配体特异性靶向SARS-CoV-2中的G四重螺旋结构，有望成为治疗新冠的有效方法。
用于靶向G四重螺旋结构的小分子通常可分为合成分子和天然产物两大类[21]、[22]。例如，合成的卟啉衍生物TMPyP4能够有效靶向SARS-CoV-2中的G四重螺旋结构，从而抑制病毒复制[23]、[24]。此外，还有研究显示，半合成的喜树碱衍生物topotecan以及天然存在的双苄基异喹啉类生物碱berbamine都能够降低含有RNA G四重螺旋结构的宿主蛋白的水平，进而阻止SARS-CoV-2伪病毒进入小鼠模型中的目标细胞[25]。不过，这些研究大多仅聚焦于体外和体内实验，研究特定配体与单个病毒或孤立宿主中的G四重螺旋结构之间的相互作用。这就引出了一个问题：是否有一种配体能够同时靶向病毒和宿主中的G四重螺旋结构，从而为抗病毒治疗提供更有效的策略？值得欣慰的是，此前针对HIV的研究已经给出了有力的概念验证。在那项研究中，一种名为NDI-MOC的定制配体能够与病毒中的G四重螺旋结构结合，抑制HIV-1的启动子活性，同时干扰宿主的CXCR4共受体，进而阻碍病毒入侵[26]。这一发现证明了同时靶向病毒复制和入侵的双重靶向策略是可行的。这种同步作用能够产生协同的抗病毒效果，为开发双重靶向抗病毒策略奠定了坚实基础。基于此，我们认为那些能够同时靶向病毒和宿主G四重螺旋结构的配体，有望成为对抗新冠病毒的更有效手段。为实现这一目标，有必要对配体与G四重螺旋结构的相互作用机制进行深入研究，同时对比不同配体的结合模式，以便开发出高亲和力的双重靶向药物。
体外和体内的实验数据为研究G四重螺旋结构与配体之间的结合亲和力提供了基础依据[27]。与此同时，分子对接和分子动力学模拟等计算技术则能够补充实验结果，帮助人们深入了解相关作用机制，进而实现配体的合理优化[28]、[29]。将实验研究与计算技术相结合，就能够从多维度了解G四重螺旋结构与配体之间的结合行为。
基于上述考虑，本研究选择了TMPyP4（以下简称TMP）、topotecan和berbamine（分别简称为TPT和BBM）作为具有代表性的双重靶向配体。这三种配体的分子结构按字母顺序展示在图1中。通过运用生物信息学工具、生物物理技术以及分子动力学模拟，我们成功识别出了SARS-CoV-2病毒及其宿主基因组中的四种稳定RNA G四重螺旋结构，并构建了它们的三维模型。随后，我们系统研究了不同配体与这些RNA G四重螺旋结构之间的结合能力及作用机制。本研究旨在建立一套完善的体外检测方法和分子动力学模拟技术体系，用于研究G四重螺旋结构与配体之间的结合情况，为筛选和优化能够同时靶向病毒和宿主G四重螺旋结构的配体提供指导，进而推动针对SARS-CoV-2的新型抗病毒药物的研发。
章节节选
生物信息学预测方法
SARS-CoV-2以及宿主基因ACE2、AXL和TMPRSS2的参考基因组分别从NCBI病毒数据库中获取，其登录号分别为NC_045512、NM_001371415.1、NM_021913.5和NM_005656.4[30]。我们使用了G4 Hunter、pqsfinder和QGRS Mapper这三种工具在参考基因组中搜索潜在的PQSs[31]。对于G4 Hunter，其窗口大小设置为25，宿主基因组的阈值设定为1.2，而病毒基因组的阈值设定为0.9。在使用pqsfinder时，最大
基因组中的PQSs
我们使用了G4 Hunter、pqsfinder和QGRS Mapper这三种生物信息学工具，对SARS-CoV-2、ACE2、AXL和TMPRSS2的基因组中的PQSs进行了搜索。对于病毒基因组，PQSs的选择是基于G4 Hunter的预测结果，而排名前三的PQSs则是通过QGRS Mapper预测得出的。对于宿主基因组，则选择了各软件预测得分较高且出现频率较高的PQSs。最终共筛选出了21个PQSs，相关信息详见表S1。随后，我们对这些PQSs进行了进一步分析
结论
SARS-CoV-2基因组及其关键宿主基因中的高度保守G四重螺旋结构是病毒感染过程中的重要功能元件。在这项开创性的研究中，我们首次系统地分析了三种配体（BBM、TMP和TPT）与来自病毒和宿主的G四重螺旋结构之间的结合特征及分子机制。我们的研究结果表明，天然来源的广谱化合物BBM和TPT与病毒和宿主中的G四重螺旋结构的结合强度较弱，其结合作用主要依赖于范德瓦尔斯力
CRediT作者贡献说明
李茂：监督、研究工作。连洪振：写作——审阅与编辑、监督、资源协调、资金获取、概念构思。沈俊文：软件相关工作。朱龙宇：写作——初稿撰写、可视化处理、结果验证、方法设计、研究工作、正式分析、数据整理。乔俊琴：写作——审阅与编辑、结果验证、资源协调、项目管理、资金获取、正式分析。郑伟娟：监督、研究工作、概念构思。朱敏：
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
资助情况
本研究得到了中国国家自然科学基金（编号为22304075、21577057、91643105、21874065和22176085）以及中国国家重点研发计划（编号为2021YFF0600800）的支持。
利益冲突声明
? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
我们衷心感谢南京大学高性能计算中心，该中心为其刀片集群系统提供了计算支持，助力完成了本文中的各项数值计算工作。
朱龙宇|朱敏|安露燕|乔俊琴|郑伟娟|沈俊文|李茂|连洪振
中国南京大学化学学院生命科学分析化学国家重点实验室及共享科研设施中心，中国南京玄林大道163号，邮编210023
