基于CRISPR的检测技术（CRISPR-Dx）因对设备要求较低而逐渐受到关注，可用于病原体检测1, 2。这类系统通常将等温扩增技术，如LAMP或重组聚合酶扩增技术（RPA），与RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶，如Cas12或Cas13a相结合，从而实现精准的病原体检测3, 4, 5, 6。不过，一些CRISPR-Dx方法，如SHERLOCK和DETECTR，需要经过两步操作，涉及多个液体处理步骤7, 8, 9，这不仅增加了污染风险，还延长了检测时间10, 11, 12。为克服这些局限，研究人员开发出了将等温扩增与CRISPR介导的切割作用整合在同一个反应体系中的单步检测方法13, 14。然而，在使用Cas12的单步CRISPR-Dx检测中，Cas12与RPA会竞争反应模板，从而降低检测灵敏度15；此外，原型间隔序列（PAM）或原型间隔侧翼序列（PFS）的需求也增加了设计有效CRISPR RNA（crRNA）的难度，尤其是针对高度变异的病毒基因组时16, 17。相较之下，基于Cas13a的单步检测方法不存在与RPA的模板竞争问题，因此可以通过定制crRNA序列来实现更高效的优化，即便检测对象是单链RNA病毒也是如此3, 18, 19。不过，Cas13a仍然需要PFS序列，且其较大的分子量给蛋白质表达带来了挑战16, 17, 20。
EsCas13d是最近从Cas13家族中发现的一种结构紧凑的RNA靶向CRISPR效应蛋白，它具有多项优势21。与其他用于检测的CRISPR蛋白相比，它体积更小，也更易于纯化，这简化了其工业化生产流程22。此外，EsCas13d不需要PFS或PAM序列，因此在设计crRNA时具有更大的灵活性21。尽管有这些优点，基于Cas13d的检测系统仍受限于多步骤操作流程、不明确的单步反应条件、缺乏冻干试剂以及复杂的核酸提取过程，这些都限制了它们的实际应用价值9, 23。
猪博卡病毒（PBoV）属于细小病毒科的一种单链DNA病毒，广泛存在于全球的猪群中24, 25。它能感染多种组织，包括粪便、淋巴结以及呼吸系统和肠道组织，且常常与其他病原体共存，这使得很难确定它是否为疾病的唯一致病因子24, 25。PBoV可被划分为多个基因群，其中第3基因群（PBoV G3）是在猪群中最为常见的类型之一25。由PBoV G3引发的感染会导致猪只出现腹泻和呼吸系统问题，尤其对仔猪危害严重，给养猪业带来巨大的经济损失25。由于传统检测方法需要专门的设备且耗时较长，因此迫切需要能够在现场快速检测感染情况并及时采取应对措施的检测技术。
为克服现有基于CRISPR的检测方法的局限性，我们开发了GENE-SENTRY，这是一种用于检测PBoV G3的快速、灵敏且无需核酸提取的检测方法。SENTRY将RPA扩增技术与基于EsCas13d的检测技术集成在同一个测试管中，从而减少了人工操作，加快了检测流程，同时也降低了污染风险。为简化样本处理流程，我们推出了GENE试剂，这是一种无需提取、可在室温下进行样本裂解的方法，无需使用商业试剂盒，也不需要重复加热步骤。我们的研究表明，使用室温下的无提取试剂处理猪只临床样本后，通过纸质比色法或管内荧光检测法，均可利用GENE-SENTRY检测出PBoV G3。此外，SENTRY试剂具备冻干兼容性，且在室温和生理温度下都能保持优异性能，这些都凸显了其在即时检测场景中的适用性。
