《BioTech》：Catching the Elusive Phytophthora: A Review of Methods and Applications for Pathogen Detection and Identification Across Agricultural, Horticultural, Forestry and Ornamental Settings
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Phytophthora属的物种是全球最具破坏性的植物病原体之一，对全球农业、园艺和林业构成重大威胁。这些游动卵菌历史上曾引发毁灭性疫情，仅举几例：爱尔兰马铃薯晚疫病；西澳大利亚桉树jarrah衰退病；欧洲栗树墨水病；美国西部海岸活橡树和塔诺橡树的栎树猝死病以
Phytophthora属的物种是全球最具破坏性的植物病原体之一，对全球农业、园艺和林业构成重大威胁。这些游动卵菌历史上曾引发毁灭性疫情，仅举几例：爱尔兰马铃薯晚疫病；西澳大利亚桉树jarrah衰退病；欧洲栗树墨水病；美国西部海岸活橡树和塔诺橡树的栎树猝死病以及英国日本落叶松的落叶松猝死病。它们引起的疾病对环境与生态造成重大影响，导致显著的经济成本，并常伴随社会后果。随着全球化加速，植物材料流动增强，尤其是全球活体植物贸易，Phytophthora向未受污染的新区域扩散已加剧。苗圃在这些病原体传播中发挥关键作用，受污染种苗贸易是其主要传播途径。然而，传统的检测技术（包括诱饵法和直接分离法）虽然有价值，但过于缓慢且劳动密集，难以满足当前诊断需求，尤其是考虑到全球植物贸易的巨大数量。当需要在短时间内处理大量潜在传染性植物材料时，这一问题尤为突出，因为通常需要向相关方提供准确及时的响应。因此，早期精确检测对于预防疫情爆发和减轻长期后果至关重要。本综述评估并对比了新型检测方法与传统方法的有效性，强调了它们在管理全球Phytophthora spp.日益加剧的威胁中的重要性。尽管技术进步，但关键挑战依然存在，限制了新诊断方法的可靠性和大规模应用。研究仍需在准确性、灵敏度和诊断成本方面弥合实验室与现场之间的差距。最近的创新集中于传感器技术和即时检测（POC）设备，以实现对植物基质、水和土壤中Phytophthora spp.更快、更灵敏、低成本的特定检测。通过这些工具增强诊断能力对于保护农业生产力、当地经济和自然生态系统至关重要。
1. 引言
Phytophthora属的卵菌（Stramenopila界）每年对广泛寄主植物（涵盖分类学上无关的科）构成持续威胁。该属成员是农业和森林生态系统最严重的威胁之一，在各大洲数百种植物上引发毁灭性疾病。这些真核类真菌生物产生有性孢子和无性孢子，在进化和毒力中起关键作用。每年，更多该属物种成为这种日益严重威胁的一部分，包括疾病复发的本地种以及因缺乏与新寄主共进化而导致影响毁灭性的引入种。Phytophthora spp.导致全球多地区树木大量死亡，多个记录详实的严重死亡和渐进衰退案例凸显其影响，例如Phytophthora alni及其杂交种对天然林和人工林中的桤木属（Alnus spp.）的影响；Phytophthora kernoviae在多种森林树木上引起茎干流汁病变；Phytophthora acerina摧毁意大利北部的假挪威槭（Acer pseudoplatanus）人工林；Phytophthora ramorum在美国西部引发“栎树猝死病”，在英国日本落叶松上引发“落叶松猝死病”；西澳大利亚西南部与樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）相关的桉树jarrah衰退病；以及欧洲板栗（Castanea sativa Mill.）上最具破坏性的疾病之一墨水病，与P. cinnamomi和P.×cambivora及其他Phytophthora spp.复合体相关。在这些案例中，Phytophthora spp.被确定为疾病的主要驱动因素。在其他情况下，这些病原体作为衰退的促成因素之一，例如橡树衰退综合征，其中Phytophthora似乎是橡树衰退和死亡的关键因素。除林业外，Phytophthora spp.在多种作物中造成重大经济损失，除了与致病疫霉（Phytophthora infestans）相关的著名马铃薯晚疫病外，还包括草莓疫霉（Phytophthora fragariae）、辣椒疫霉（Phytophthora capsici）、烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）和隐地疫霉（Phytophthora cryptogea），它们导致作物严重受损和减产。全球范围内，超过66%的根部病害和90%以上的木本植物颈根问题归因于Phytophthora spp.。然而，在许多情况下，非生物因素或次生病原体——而非主要Phytophthora病原体——被视为主要致病原因。对苗圃环境中Phytophthora spp.发生的担忧也被提出，因为一旦受感染植物被引入未受污染的田地、森林或城市绿地，存在快速传播的风险。这一问题尤其令人担忧，因为它直接影响农业生产、森林健康和城市绿化，同时园艺苗圃可能通过贸易成为植物材料分布的重要枢纽。此类活动通过受污染的绿色废弃物和受感染植物促进Phytophthora spp.的传播，进而可能扩散病原体并对生物多样性构成威胁。例如，Phytophthora boodjera在苗圃生产区周围的植被中被检测到，导致桉树苗圃的病害损失。此外，P. ramorum最初在北美苗圃中被报道，随后在橡树天然林中爆发毁灭性疫情，主要影响海岸活橡树（Quercus agrifolia）和相关塔诺橡树（Notholithocarpus densiflorus）。此外，对欧洲苗圃种苗的调查已鉴定出超过20种不同的Phytophthora spp.，存在于森林树木、观赏植物和灌溉系统中。开发快速准确的诊断方法至关重要，原因包括：实现早期干预（如根除）；实施适当管理策略，包括预防措施如入境口岸检查及敏感地点监测；优化全境监测，防止病原体从初始疫点进一步扩散；为立法者提供信息以制定适当立法措施（如禁止从特定区域进口某些食品和植物材料及其他检疫措施）。本综述概述了当前检测Phytophthora的诊断方法，强调了应对农业和林业系统中这些病原体日益增长的威胁，亟需快速可靠的检测工具。为满足商业需求，这些工具还必须提供快速结果。检测Phytophthora等病原体具有挑战性，因为其症状常非特异性，阻碍早期发现；需要选择性基质进行分离，可能使鉴定过程复杂化；共感染可能掩盖诊断；且某些Phytophthora spp.可在土壤中潜伏存活不确定时间而不诱导寄主症状，使检测更加困难。全面诊断通常涉及将传统诊断技术与分子方法结合，前者常由后者补充。
2. 传统检测方法
Erwin和Ribeiro对Phytophthora spp.的传统检测方法进行了广泛描述，主要包括：对患病植物材料进行直接显微镜检查；通过诱饵法从感染植物组织、水和土壤中分离；以及使用通用或选择性琼脂培养基。Phytophthora spp.仅感染健康植物材料，且即使无明显症状，病原体也可能存在。这些生物体从坏死组织中分离非常困难，因为坏死组织常含有大量次生病原体。因此，从死亡植物组织中分离Phytophthora是一项重大挑战。然而，最有效的采样策略通常涉及从轻微受影响的树木或从已表现出症状或已死亡的树木周围采集土壤样本。
2.1. 诱饵法
诱饵法是从多种环境基质中分离Phytophthora病原体广泛使用的方法。该技术利用易感植物部位作为活饵，吸引从孢子囊释放的游动孢子。游动孢子因其负向地性和趋化行为被吸引至诱饵，引导其向上移动朝向诱饵。诱饵效果取决于多种因素，如所用诱饵植物种类、持续时间、深度和生长培养基。常见诱饵包括叶圆片、子叶、果实和幼苗，森林生态系统中常用杜鹃花和橡树叶。诱饵组织上出现可见病斑通常标志着诱饵成功，因为该病斑由Phytophthora spp.感染引起。随后将感染诱饵组织培养在选择性培养基上，可实现致病种的准确可靠鉴定。从土壤和水环境中分离Phytophthora可使用多种诱饵技术。在实验室条件下，诱饵通常浸没在淹水土壤盘中以吸引致病游动孢子，或使用苹果诱饵。或者，诱饵可直接在河流或灌溉渠中孵育。然而，必须注意，此过程是半选择性的，主要检测产生游动孢子的物种，可能忽略缺乏游动孢子的微生物。这一限制可能导致对实际存在类群的采样不足，低估物种多样性。此外，实验室环境中的特定条件可能导致无法检测到卵孢子群体，卵孢子是存活结构，可能构成土壤中Phytophthora接种体的重要部分。这些卵孢子结构可能需要实验室环境中不存在的不同萌发条件。为解决这一挑战，随时间发展了一系列改进和优化的诱饵方案。尽管存在局限性，诱饵法仍是一种成本效益高、简单且成熟的方法，尤其适用于检测河流、溪流和灌溉渠等水环境中的Phytophthora，诱饵可长时间浸没以恢复低病原体水平。然而，在阴性结果的情况下，建议进行多次诱饵尝试以确认样品中无Phytophthora。
2.2. 分离与形态学鉴定
从多种环境样品（包括植物组织、土壤和水）中分离Phytophthora病原体是准确鉴定和后续研究的关键步骤。常用方法是将感染植物组织接种到含有抗菌和抗真菌剂的选择性琼脂上。这种选择性培养基促进Phytophthora生长，同时抑制其他不需要的微生物，从而通过其独特的形态特征进行鉴定。然而，分离过程存在若干挑战。例如，Phytophthora在选择性琼脂上生长困难的原因尚不完全清楚，但可能源于与组织样品中其他微生物的拮抗作用、植物酚类物质的抑制或卵孢子或厚垣孢子萌发的抑制。这些因素可能使Phytophthora类群的准确检测复杂化。在土壤和水样品中，选择性培养基的使用对于克服大量污染微生物带来的挑战至关重要。基本培养基如胡萝卜琼脂（CA）、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、麦芽糖葡萄糖琼脂（MEA）、V8培养基、玉米粉琼脂（CMA）和水琼脂（WA）通常不足以从寄主组织或诱饵过程中分离Phytophthora，但选择性培养基的应用显著提高了病原体分离成功率。非选择性培养基因其他微生物竞争而不适用，尤其当分离依赖于休眠Phytophthora繁殖体（如卵孢子和厚垣孢子）的萌发时。低营养琼脂培养基如玉米粉琼脂常作为基础培养基，与抑制多种不需要的非靶标真菌或细菌的抗菌化合物一起使用。例子包括3-P培养基（添加匹马霉素、青霉素、多粘菌素B的玉米粉琼脂）、P10VP培养基（添加匹马霉素、万古霉素和五氯硝基苯（PCNB）的玉米粉琼脂）、P10ARP培养基（添加匹马霉素、氨苄青霉素、利福平和PCNB的玉米粉琼脂）以及添加苯菌灵、PCNB、制霉菌素、氨苄青霉素、利福平和恶霉灵的改良培养基。恶霉灵可添加到其他选择性培养基中。然而，添加恶霉灵可抑制许多腐霉属（Pythium）和被孢霉属（Mortierella）物种，但对某些Phytophthora spp.也有毒性，可能产生不具代表性的结果。含有制霉菌素22.72 ppm、氨苄青霉素100 ppm、利福平10 ppm、五氯硝基苯（PCNB）100 ppm和恶霉灵50 ppm的NARPH培养基已被广泛使用。PCNB的致癌性意味着不应使用该化合物，许多研究人员已将其排除，如Simamora等人使用NARH（制霉菌素、氨苄青霉素钠、利福平和恶霉灵）。这些选择性培养基的配方基于商业制备的基本培养基，如上文提到的CMA。此外，V8琼脂也可作为基础培养基，如PARPNH-V8琼脂培养基。在Phytophthora分离中值得注意的还有使用合成毛霉琼脂（SMA），由葡萄糖、天冬酰胺、KH2PO4、MgSO4、盐酸硫胺素、琼脂和蒸馏水组成。文献中存在多种改良形式，并根据需要添加抗生素和抗真菌剂。鉴定Phytophthora spp.需要检查无性期和有性期的特征，以及菌落形态。重要的无性特征包括孢子囊乳突和脱落性。脱落性孢子囊上残留的柄长度是另一个好的分类性状。孢子囊可能显示内部或外部增殖，如延伸或嵌套。孢子囊梗可简单（不分枝）或分枝；分枝形式分为伞形、简单合轴或复合合轴。菌丝膨大和厚垣孢子（如果存在）可能出现在末端或间生位置，形状和分布各异。尽管孢子囊形状多变，但通常对诊断帮助较小。在有性阶段，关键特征包括生殖方式（同宗配合和异宗配合）、配子囊形态和卵孢子类型（满器或不满器）。菌落形态，包括生长模式、质地、紧密性、表面拓扑结构以及在选择性培养基上的生长速率，提供额外的诊断线索。尽管有用，基于形态和培养标准的传统分离方法耗时，需要专业微生物学/真菌学专业知识，且不总能得出明确结论。这些方法通常不够灵敏，无法在症状前阶段检测Phytophthora，并且普遍认为通过诱饵技术未能检测到Phytophthora并不一定表示其不存在。Phytophthora表现出季节性活动和波动种群，可快速从不可检测水平转变为高接种密度，尤其在自然生态系统中。因此，应谨慎解释环境中Phytophthora的缺失。成功分离的一大优势是获得Phytophthora存在的客观证据，并可获取纯培养物用于进一步表征和研究。建立关键培养物库可增强后续分析，并为理解这群病原体提供有价值的数据。在复杂自然环境中，如植物组织，病原微生物在快速定殖感染寄主的多种微生物中占少数。尽管使用了选择性培养基，但由于分离平板上不需要的真菌或细菌生长更快，分离病原体可能具有挑战性。因此，通常优先选择血清学或分子分析进行诊断。
3. 免疫检测方法
血清学和免疫学技术已被证明在通过植物组织、土壤和水样品检测Phytophthora spp.方面非常有效。这些方法可调整为更简单、更快速的检测选项，不仅适用于实验室分析，也适用于现场应用。针对Phytophthora spp.的多克隆和单克隆抗体均可商业获得，使开发特异性检测分析成为可能。其中，酶联免疫吸附测定（ELISA）仍是广泛使用的工具。这种生化诊断方法基于识别植物病原体特定抗原的抗体，结合时产生颜色变化。商业ELISA试剂盒有多种形式，包括利用多孔板的高通量应用。这些试剂盒已证明在接种后一周即可在杜鹃花根中检测到樟疫霉（P. cinnamomi），四天内可在覆盆子根中检测到草莓疫霉树莓变种（Phytophthora fragariae var. rubi），以及检测到栎树猝死病菌（P. ramorum）。侧流装置（LFD），也称为免疫试纸条，提供即时诊断解决方案。LFD是一种易于操作的诊断设备，采用侧流免疫层析技术（LFIA），无需复杂设备即可快速检测多种样品类型中的特定抗原。使用商业LFD，已在多种橡树中检测到栎树猝死病菌和P. kernoviae。测试简单，3-5分钟内出结果，验证了其实用性。与分离和实时PCR等实验室方法的比较分析显示，灵敏度为87.6%，特异性为82.9%，总体效率为95.6%，优于视觉症状评估（P. ramorum和P. kernoviae为20%-30%）。这证明了LFD测试在敏感地点（如港口、机场、海关、苗圃等）检查中作为有效诊断工具的重要性，以及作为初步现场筛选以识别需要详细实验室分析以进行物种鉴定的样品的方法。相关研究表明，包括ELISA和LFD在内的免疫学方法对P. ramorum检测的灵敏度高于物种特异性PCR，因此可作为有效的预筛选工具。在水环境中，游动孢子捕获免疫测定（ZTI）在检测腐霉属和Phytophthora spp.方面比传统方法具有更高的灵敏度，而免疫诊断试纸条已证明对受感染根区的原位评估有效。这些免疫学技术因此成为各种背景下快速灵敏检测病原体的宝贵工具。Pettitt将游动孢子捕获免疫测定描述为适合水监测以检测和鉴定Phytophthora spp.的方法，而试纸条、LFD和ELISA被归类为中等至高度有效的监测方法。这些方法的优点（与ELISA类似）包括能够在无需分离病原体的情况下提供快速结果。它们已成功检测到多种样品类型中的Phytophthora spp.，包括植物叶片、木质组织、根、土壤和灌溉水。在某些情况下，这些测定作为预筛选工具，以减少需要进行后续更昂贵、更耗时确认测试的样品数量，从而优化大体积样品研究。一个显著例子是批准高通量ELISA方案作为国家P. ramorum调查中的主要筛选方法。此外，LFD提供了额外优势，便于现场诊断，无需专门的实验室基础设施。它们用户友好、便携，且能在十分钟或更短时间内提供结果，从而支持疾病管理中的即时决策。相反，这些测定存在局限性，阳性结果通常需要PCR或分离技术确认。交叉反应性，特别是与密切相关的卵菌如腐霉属（Pythium spp.）和霜霉属（Peronospora）的交叉反应，也有记录，可能导致假阳性和误诊。植物病理学的最新进展涉及血清学与分子扩增方法的整合，以增强病原体检测的灵敏度、特异性和快速性，特别是针对Phytophthora spp.。例如，Dai等人开发了一种重组酶聚合酶扩增结合侧流试纸条（RPA-LFD）检测法，用于快速检测大豆疫霉（Phytophthora sojae），检测限为10皮克基因组DNA。该检测法在55.4%的样品中检测到P. sojae，优于其他方法如环介导等温扩增（54.6%）、常规PCR（46.9%）和叶片圆盘诱饵法（38.5%-40.0%）。类似地，针对Pcinn13739基因设计了用于检测樟疫霉（P. cinnamomi）的RPA-LFD检测法。该方法显示检测限为10 pg/μL基因组DNA，灵敏度高于传统PCR诊断。此外，侧流装置（LFD）等设备的便携性为现场应用提供了显著优势，这已在其他病原体的现场诊断中得到证明。一个示例是Tomlinson等人开发的用于P. ramorum的现场快速检测系统，该系统采用环介导等温扩增（LAMP）结合侧流装置（LFD）可视化。
4. 分子检测方法
4.1. 聚合酶链式反应（PCR）
近年来，基于DNA的方法因其高特异性和稳健性而成为病原体检测的首选方法。聚合酶链式反应（PCR）及其变体无疑是最流行且研究最广泛的核酸扩增技术。此外，PCR扩增技术的进步进一步提高了这些技术的灵敏度和可靠性。因此，基于PCR的方法已广泛用于Phytophthora spp.的检测，显示出高水平的特异性和灵敏度。常规PCR使用特异性引物、热稳定聚合酶、核苷酸和热循环扩增靶标DNA。重要的是，检测特异性取决于针对独特基因组区域的引物设计，扩增通常通过琼脂糖凝胶电泳确认。多年来，研究人员开发了针对多种基因组区域的PCR检测方法，如核糖体DNA（rDNA）的内部转录间隔区（ITS）和基因间间隔区（IGS）区域。这些方法允许在属水平检测，并常能区分物种。例如，Silvar等人开发了三个特异性针对辣椒疫霉（P. capsici）的PCR引物CAPFW、CAPRV1和CAPRV2；两个引物组CAPFW/CAPRV1和CAPFW/CAPRV2在常规PCR中的检测限为5 pg，而在巢式PCR中，两者的检测限均为0.5 fg。尽管如此，CAPFW/CAPRV2引物组在常规PCR中用于检测接种植物中的P. capsici DNA。在接种后8小时，即可在感染但无症状的茎秆样品中检测到。类似地，针对ITS区域的引物已被证明可高特异性检测致病疫霉（P. infestans）。Judelson和Tooley采用高度重复的DNA序列，开发了引物组以检测P. infestans，检测限达10 fg，特异性良好。另一个例子是Liew等人的工作，他们对苜蓿疫霉（P. medicaginis）及相关物种的完整IGS 2区域进行测序，然后在P. medicaginis的IGS2内开发了寡核苷酸引物。所得引物特异性扩增P. medicaginis DNA，灵敏度高，可检测低至4 ng的DNA，即使在寄主-病原体DNA比例为1,000,000:1时也是如此。因此，该方案对鉴定感染植物组织中的Phytophthora有效，为疾病诊断和管理提供了宝贵工具。然而，常规PCR存在一定局限性，包括对植物组织中常见抑制剂的敏感性、无法区分活体与非活体生物以及缺乏定量能力。
4.2. 基于PCR的变体
为克服基本PCR的挑战，开发了几种技术改良。
4.2.1. 多重PCR
多重PCR可使用不同引物组同时检测多种病原体。一个显著例子是Otsubo等人为日本检疫控制开发的多重PCR。该检测使用了针对检疫性Phytophthora spp.的特异性引物，以及针对非检疫性Phytophthora spp.（唯一非检疫种烟草疫霉P. nicotianae）的引物，以及作为内部对照的植物引物。然而，该技术可能因引物竞争而降低灵敏度。因此，调整引物浓度比对于克服引物竞争导致的扩增差异至关重要。
4.2.2. 巢式PCR
巢式PCR通过两轮扩增（使用内部引物）提高灵敏度和特异性。尽管有其优势，但更劳动密集且增加污染风险。例如，Schena等人开发了基于PCR的“分子工具箱”，即巢式PCR，第一轮使用属特异性引物Yph1F-Yph2R，第二轮使用物种特异性引物。该方案显示出高特异性，并且灵敏度足以在感染叶片、受污染土壤和水样品中检测到靶标物种。Judelson和Tooley表明，开发的引物组在巢式PCR中达到0.1 fg P. infestans DNA的检测限，而PCR的检测限为10 fg。Ippolito等人也得出相同观察结果，强调巢式PCR达到1 fg/μL的检测限，而常规PCR为1 pg/μL，从而增强了灵敏度。
4.2.3. 定量PCR
定量PCR（qPCR）通过使用荧光检测系统实时定量DNA，消除了扩增后凝胶电泳的需要，从而提高了诊断准确性。该技术使用非特异性DNA结合染料（如SYBR Green I）或序列特异性杂交探针（包括水解探针和分子信标）监测DNA扩增，后者提供更高特异性。例如，Osawa等人开发了一种实时PCR检测法，用于估计旱地土壤中P. infestans的种群密度和接种潜力。在类似应用中，基于Ras相关蛋白基因Ypt1的多重实时定量PCR，量化了2017和2018年中国32个猕猴桃果园128份土壤样品中恶疫霉（P. cactorum）、樟疫霉（P. cinnamomi）和侧生疫霉（P. lateralis）的种群密度。值得注意的是，Schenck等人开发了一种针对Ypt1基因的实时PCR检测法，实现了高灵敏度和特异性，可检测植物组织中的侧生疫霉（P. lateralis），检测阈值低至47个DNA拷贝。
4.2.4. 微滴式数字PCR
除qPCR外，微滴式数字PCR（ddPCR）被用作检测和定量植物病原体的诊断工具，相比传统定量PCR（qPCR）具有优势。研究表明，ddPCR在检测烟草植物和土壤样品中的烟草疫霉（P. nicotianae）方面具有高灵敏度和精密度。该技术对PCR抑制剂具有更高耐受性，且在低病原体浓度下具有更高准确性。Ristaino等人开发了一种用于P. infestans的环介导等温扩增（LAMP）检测法，并将该方法与常规PCR、实时LAMP和微滴式数字PCR进行了比较。微滴式数字PCR显示出最低的检测阈值（100 fg/μL），而常规PCR为10 pg/μL，SYBR Green LAMP（在mReader上读取）为584 fg/μL。这些发现强调了ddPCR作为复杂环境样品中植物病原体早期诊断的稳健可靠方法的潜力，从而为疾病管理策略提供信息。总体而言，基于PCR的方法学是用于检测植物病原体（包括Phytophthora spp.）非常通用且可靠的工具。技术进步不断改进其灵敏度、特异性和在不同诊断背景下的适用性。因此，这些技术是分子病原体分析的关键参考点，并为与更新的互补诊断方法整合提供了基础。
4.3. 等温扩增方法
与PCR利用三个不同温度的热循环实现DNA链分离、引物退火和靶序列延伸不同，等温扩增可在单一温度下实现核酸扩增，无需耗能且技术复杂的热循环过程。由于这些特性，等温技术正被采用或被认为有希望用于现场即时检测。其中，环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）是检测Phytophthora最常用的方法。LAMP是诊断应用中扩增病原体模板的替代技术。LAMP利用六个基因区域进行扩增。它涉及设计退火到靶标不同区域的引物，利用具有链置换活性的DNA聚合酶在恒定温度下促进扩增。值得注意的是，Khan等人证明，在65°C下60分钟内进行的LAMP反应可检测到高达1.28×10
-4 ng/μL的纯P. infestans基因组DNA。LAMP检测与其他Phytophthora spp.、卵菌或真菌病原体无交叉反应。此外，该检测的灵敏度能够检测低至1.28×10
-4 ng/μL的DNA浓度，比巢式PCR（1.28×10
-3 ng/μL）高10倍，比实时PCR（1.28×10
-2 ng/μL）高100倍，比常规PCR（1.28×10
-1 ng/μL）高10
3倍。日本开发了一种多重LAMP检测，用于检测P. ramorum、P. lateralis、P. kernoviae（日本的检疫性病原体）以及本地种P. nicotianae。此外，中国的一项研究基于tigA基因开发了物种特异性LAMP检测，用于检测猕猴桃果园土壤中最普遍的病原体恶疫霉（P. cactorum）。许多其他研究人员提出了LAMP检测作为高度特异性的创新诊断方法，包括Dai等人，他们使用新的靶基因Pcinn100006评估樟疫霉（P. cinnamomi）的检测。RPA是一种与PCR相当的技术，但不同之处在于它利用酶促过程而非热循环进行DNA链分离和引物退火。RPA反应可在30-42°C的温度范围内进行，最适温度为39°C。引物设计的简单性为技术提供了优于LAMP等技术的优势。与LAMP类似，RPA对常见PCR抑制剂相对不敏感。RPA用于快速核酸检测的灵敏度可通过与CRISPR技术整合显著增强。最近，这种组合方法已用于诊断Phytophthora spp.，如P. nicotianae和P. syringae。值得注意的是，为增强松疫霉（P. pini）的检测，Dai等人建立了RPA-LFD和RPA-CRISPR/Cas12a检测法。前者可在约30分钟内完成，后者需要50分钟。灵敏度方面，RPA-LFD可检测的最低浓度为10 pg/μL，而RPA-CRISPR/Cas12a能够检测1 pg/μL的P. pini。等温扩增技术的最新进展出现在解旋酶依赖性扩增（HDA）的应用之后，该技术已成功用于检测Phytophthora spp.，特别是P. kernoviae，以Ypt1基因为靶标。该方法结合芯片杂交和银纳米颗粒可视化，实现了高灵敏度的现场适用检测。与LAMP类似，HDA扩增子可通过多种方法检测，包括凝胶电泳、荧光、电化学检测和侧流分析。尽管简单，但HDA易受非特异性扩增影响，因此需要彻底优化和筛选引物以避免假阳性和假阴性结果。
4.4. 基于DNA微宏阵列的方法
DNA阵列作为基因表达谱分析的工具，也可用于微生物的鉴定和区分。微阵列和宏阵列技术已被设计用于检测和鉴定多种Phytophthora spp.及其他植物病原体。Sikora等人开发了一种基于挂锁探针的微阵列方法，用于同时检测多种Phytophthora spp.，采用比色读数，以物种特异性分辨率区分了九种Phytophthora spp.，而其他物种则以组别鉴定。Wong和Smart开发了一种用于DNA宏阵列系统的显色检测技术，作为化学发光检测的替代方法，用于鉴定葱叶枯病菌（Stemphylium solani）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）。Chen等人设计了一种基于膜的寡核苷酸阵列，利用多种DNA标记（ITS、cox1和cox2-1间隔区）从环境样品中检测和区分多种Phytophthora spp.。Zhang等人设计了一种宏阵列系统，采用基于ITS序列的寡核苷酸，检测茄科作物的主要真菌和卵菌病原体。这些基于阵列的方法为植物病原体（包括Phytophthora spp.）提供了多重检测能力，适用于多种基质和标本类型。因此，DNA阵列技术已成功用于从不同生境中同时检测多种微生物，包括多种Phytophthora spp.。
4.5. 下一代测序（NGS）
下一代测序（NGS）技术已成为检测和鉴定环境样品中Phytophthora spp.的强大工具。与传统方法相比，NGS提供更高的调查能力、更高的检测灵敏度和更高的成本效益。该方法为作物保护利益相关者（包括负责植物健康检查和疾病管理的监管机构）提供了宝贵的指导。在最近一项研究中，使用Phytophthora特异性条形码引物扩增线粒体DNA间隔区ATP合酶亚基9-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基9（ATP9-NAD9）。通过该方法，使用下一代测序（NGS）鉴定了多种Phytophthora spp.，随后通过物种特异性定量聚合酶链式反应（qPCR）检测确认了其身份。多项研究有效利用下一代测序（NGS）评估了不同生态系统中土壤和水样品中Phytophthora spp.的多样性。例如，环境DNA（eDNA）的扩增子焦磷酸测序揭示了广泛的Phytophthora spp.多样性，单次研究鉴定出多达37个系统发育型。Català等人记录了在土壤样品中检测到13种Phytophthora spp.，而同一地点采集的水样品中检测到35种。这一结果强调了水样品通常比土壤样品具有更高的物种多样性。此外，该研究强调了水采样的方法学优势，因为土壤预处理比水滤器的相对快速处理更费力，后者有助于在一天内制备扩增子文库。在最近一项调查中，Landa等人采用高通量Illumina测序，靶向广泛认可的核糖体RNA内部转录间隔区1（ITS1）区域，并与线粒体细胞色素c氧化酶I（COI）基因标记进行比较，评估英国受干扰和未受干扰土壤中Phytophthora的多样性。总体而言，将多种采样方法学与下一代测序（NGS）整合，并通过定量PCR（qPCR）验证，增强了调查能力和检测灵敏度，同时减少了人工劳动及相关成本。这些技术进步对于帮助监管机构识别Phytophthora spp.的潜在入侵途径和改善植物检疫程序至关重要。
4.6. 主要靶标区域
许多编码（基因）和非编码（基因间）DNA区域已被用作病原体分型和检测引物开发的首选靶标，其中许多涉及重要Phytophthora spp.的菌株鉴定。由于易于扩增多拷贝核糖体基因区域，核糖体基因复合体常用于病原体鉴定。最广泛使用的核苷酸序列是内部转录间隔区（ITS）区域，位于转录单元内，核小亚基和大亚基rRNA基因之间；非转录的基因间间隔区（IGS），位于重复单元内25S（或28S）基因下游和18S基因上游；60S核糖体蛋白L10，位于核糖体大亚基（60S）内的保守核糖体蛋白，具体在亚基间侧，以及侧翼区域。其他引物设计的首选靶标包括β-微管蛋白（beta Tubulin），一种微管组成蛋白；烯醇化酶（enolase），糖酵解中的必需酶；热休克蛋白90（heat shock protein 90），一种细胞伴侣蛋白；线粒体cox1位点，编码线粒体细胞色素氧化酶；线粒体cox2位点，也编码线粒体细胞色素氧化酶；线粒体NADH脱氢酶亚基1（Mitochondrial NADH Dehydrogenase Subunit 1）及其侧翼区域；线粒体NADH脱氢酶亚基9（Mitochondrial NADH Dehydrogenase Subunit 9）及其侧翼区域；线粒体核糖体蛋白S10及其侧翼区域；线粒体sec非依赖性转运蛋白
