肺大细胞神经内分泌癌的蛋白质组学特征揭示分子特征和治疗策略

《SCIENCE ADVANCES》：Proteogenomic characterization of pulmonary large-cell neuroendocrine carcinoma identifies molecular features and therapeutic strategy

　　

肺大细胞神经内分泌癌（LCNEC）是一种罕见但高度侵袭性的非小细胞肺癌（NSCLC）亚型，治疗选择有限。研究人员对107例患者（81例纯LCNEC和26例复合LCNEC）的肿瘤和配对正常邻近组织进行了全面的蛋白质组学分析。APOBEC突变特征与肿瘤发生和免疫抑制过程密切相关，KEAP1突变与LCNEC合并NSCLC的代谢重编程相关。观察到神经内分泌和免疫表型之间的冲突关系。研究人员确定了三种LCNEC亚型，具有独特的预后特征、微环境失调、遗传改变和潜在治疗靶点。白细胞介素-33（IL-33）成为与增强T细胞浸润和抗肿瘤活性相关的关键治疗生物标志物。研究人员进一步通过定点诱变优化重组IL-33（rIL33）并开发聚乙二醇化rIL33，证明其在食蟹猴中延长循环时间并在小鼠模型中具有优越的免疫激动剂活性。总体而言，这项研究提供了对LCNEC生物学的见解，并为肺癌提供了有前景的创新免疫激动剂治疗策略。

**论文解读：肺大细胞神经内分泌癌的蛋白质组学特征揭示分子特征与治疗策略**

**研究背景与动机**

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因。肺大细胞神经内分泌癌（LCNEC）是一种罕见但高度侵袭性的非小细胞肺癌（NSCLC）亚型，约占所有切除肺癌的2%–3%，年发病率估计为44,000–66,000例，且呈上升趋势。LCNEC临床表现为广泛转移和极差预后，5年生存率仅15%–25%。当前主要治疗手段为手术和化疗，但化疗疗效有限，且缺乏标准化疗方案。此外，LCNEC常与NSCLC或小细胞肺癌（SCLC）成分共存（称为复合LCNEC，C-LCNEC），占约20%–25%的病例，但其分子差异尚不明确。尽管基因组和转录组研究初步揭示了LCNEC的分子景观，但针对该独特亚型的靶向治疗开发仍因分子机制认知不足而受阻。蛋白质作为肿瘤表型的直接执行者，系统性的蛋白质组学研究在LCNEC中尚属空白。因此，研究人员开展了一项整合蛋白质组学分析，旨在揭示LCNEC的基因组畸变、分子特征和治疗生物标志物，为患者分层和靶向治疗提供依据。该研究发表于《SCIENCE ADVANCES》。

**关键技术与方法**

研究人员利用来自上海肺科医院（同济大学）107例手术切除LCNEC患者的肿瘤及配对正常邻近组织，开展了整合蛋白质组学分析。核心技术包括：全外显子测序（WES，平均深度>100×）检测体细胞突变和拷贝数变异（CNA）；RNA测序（RNA-seq）评估转录组表达；基于串联质量标签（TMT）标记的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行全局蛋白质组和磷酸化蛋白质组定量分析。此外，还采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析小鼠模型肿瘤浸润免疫细胞，以及数据非依赖性采集（DIA）质谱评估食蟹猴血清中PEG化IL-33的药代动力学特性。

**研究结果**

1. **The proteogenomic landscape of LCNEC**：通过WES、RNA-seq及蛋白质组学分析，研究人员绘制了LCNEC的多组学景观。鉴定出6个显著突变基因（TP53、RB1、KEAP1、MAP3K、STK11、POU4F1），并发现TP53与RB1共突变关系。PI3K/AKT/mTOR通路突变与高肿瘤突变负荷（TMB）相关，高TMB患者总生存期（OS）更长。突变特征分析识别出APOBEC特征和吸烟特征，APOBEC特征与KEAP1和PIK3CA突变显著相关，且与免疫评分及免疫检查点蛋白（IDO1、LGALS9）表达正相关。

2. **Effects of copy number alterations in LCNEC**：CNA分析显示，拷贝数改变对mRNA、蛋白质和磷酸化蛋白存在顺式调控效应。鉴定出2q31.1扩增（21.5%患者）与不良预后显著相关，该区域内的LNPK蛋白高表达与OS缩短相关，且LNPK与N-聚糖生物合成途径关键酶（如MGAT5、MAN1A2）正相关，后者亦为独立风险因素。

3. **Proteomic alterations associated with tumorigenesis and prognosis**：对比肿瘤与正常组织，鉴定出974个差异表达蛋白，其中DNA复制、细胞周期等通路上调，补体级联、细胞外基质（ECM）相互作用等通路下调。在磷酸化层面，PDHA1 Ser293位点磷酸化显著增强，且与不良预后相关，而蛋白丰度变化不显著。激酶-底物富集分析（KSEA）揭示WEE1和CDK1活性升高。FBP1被鉴定为预后标志物和抑癌基因，其高表达与良好预后及免疫通路激活相关，过表达FBP1在H727细胞系及CDX模型中抑制肿瘤生长。

4. **KEAP1 mutation drives metabolic reprogramming in C-LCNEC with NSCLC**：在复合LCNEC（合并NSCLC）亚型中，KEAP1突变频率显著增高。KEAP1突变导致磷酸戊糖途径关键酶（如G6PD）和NRF2调控蛋白上调，并富集谷氨酰胺代谢途径，提示KEAP1突变驱动代谢重编程，联合谷氨酰胺酶和G6PD抑制可能成为治疗策略。

5. **Immune landscape and regulation in LCNEC**：基于xCell免疫评分进行共识聚类，识别出免疫热肿瘤和冷肿瘤簇。热肿瘤簇特征包括高免疫评分、高TMB、低肿瘤免疫功能障碍和排斥（TIDE）评分、高APOBEC特征及LRP1B突变富集，且免疫检查点蛋白（CTLA4、PD-1、PD-L1、LAG3）上调。冷肿瘤簇则高表达神经内分泌转录因子（INSM1、SALL2、ONECUT2），且免疫评分与神经内分泌评分呈显著负相关，表明神经内分泌与免疫表型存在冲突。

6. **Proteomic subtypes with distinct biological and clinical features**：通过非负矩阵分解（NMF）聚类，识别出三种蛋白质组学亚型（C1、C2、C3），OS差异显著。C1亚型以免疫活性高、STAT家族转录因子活性强、EMT通路富集及受体酪氨酸激酶（RTK，如PDGFRA、AXL）上调为特征，提示AXL联合免疫检查点阻断（ICB）治疗可能有效。C2亚型呈SCLC样特征，高表达组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族和EZH2，且对HDAC抑制剂敏感，与E2F靶点和RB丢失通路富集相关，提示HDAC联合EZH2抑制可作为治疗选择。C3亚型OS最差，以高氧化磷酸化（OXPHOS）活性、线粒体复合物I/III/IV上调（非复合物II）和神经内分泌特征为标志，且PI3K-NEU基因突变和活性高，与不良预后相关，提示线粒体复合物I抑制剂可能有效。

7. **IL-33 preactivation enhances the antitumor efficacy of expanded γδT cells**：IL-33在LCNEC肿瘤中显著下调（约6倍）。在小鼠Lewis肺癌（LLC）CDX模型中，重组IL-33（rIL33）治疗显著抑制肿瘤生长，并增加CD45+免疫细胞浸润。scRNA-seq分析显示，rIL33处理增加CD4+ T、CD8+ T和γδT细胞浸润，促进CD4+ T细胞克隆扩增，并增强细胞毒性标志物（Gzmb、Prf1）表达。γδT细胞与CD8+ T细胞存在强相互作用，表明IL-33预激活可增强γδT细胞的抗肿瘤活性。

8. **Cysteine mutation and PEGylation prominently enhanced the IL-33 immune agonist activity**：为延长IL-33的半衰期，研究人员引入半胱氨酸突变和聚乙二醇化（PEG化）修饰。通过筛选不同突变组合，获得GSSC突变体，并制备PEG5k和PEG20k修饰的rIL33。在LLC和CT26 CDX模型中，PEG20k-GSSC表现出优越的肿瘤生长抑制效果。在食蟹猴中，PEG化rIL33及其下游标志物（IL18BP、IL1RL1）在给药后72小时内保持稳定强度，表明循环时间延长。

**总结与讨论**

本研究通过整合基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据，首次系统描绘了LCNEC的蛋白质组学景观。讨论部分指出：APOBEC突变特征可能驱动LCNEC发病和免疫抑制，并可作为ICB疗效的潜在预测标志物；KEAP1突变通过激活NRF2和谷氨酰胺代谢提供治疗靶点；免疫景观分析揭示了热肿瘤簇（可能获益于ICB）与冷肿瘤簇（与神经内分泌表型相关）的对抗关系；三种蛋白质组学亚型（C1、C2、C3）具有独特的生物学特征和治疗脆弱性，为个性化治疗提供了依据。IL-33在肿瘤中显著下调，其重组及PEG化形式（GSSC-PEG20K）在小鼠模型中表现出强效免疫激动活性，并在非人灵长类中延长循环时间，无显著不良反应，表明其作为LCNEC免疫治疗策略的潜力。

研究结论部分翻译如下：总之，整合全面的基因组、转录组、蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据，揭示了仅凭基因组和转录组分析无法完全捕捉的LCNEC潜在分子机制和疾病亚型。这些发现、分析和基础数据有望为LCNEC的更有效临床治疗做出贡献，并为深入探究该疾病的致癌机制、进展和治疗策略提供宝贵资源。