综述：葡萄藤全生物：微生物组辅助的葡萄栽培与诊断方法

《AgriEngineering》：The Grapevine Holobiont: Microbiome-Assisted Viticulture and Diagnostic Approaches

　　

现代葡萄栽培正在经历范式转变，从以植物为中心的观点转向全生物（holobiont）概念，该概念将葡萄藤（Vitis vinifera L.）及其相关微生物群视为一个共同进化的功能单元。本综述综合了当前关于葡萄藤全生物的知识，确定了微生物组组装的驱动因素（基因型、环境、管理）及其对植物健康和葡萄酒品质的功能影响。研究人员讨论了植物健康的支柱，将疾病定义为菌群失调（dysbiosis）状态，而不仅仅是病原体的存在。特别关注了微生物组的空间区划，从根际（rhizosphere）的门控机制到花际（anthosphere）的短暂多样性。此外，研究人员强调了从培养依赖技术到下一代测序（NGS）的方法学演变，以及MALDI-TOF MS作为快速、经济高效的实时监测工具的新兴作用。最后，研究人员提出了一条微生物组辅助葡萄栽培的路线图，利用合成微生物群落（SynComs）和全基因组育种（hologenomic breeding）来增强对气候变化的抗性。

1. 引言
传统上，葡萄栽培病理学基于柯赫法则（Koch's postulates）在还原论的一病原体一疾病范式下运作，而当代系统生物学已促使向整体观的根本性转变。如Berg等人[1]的开创性框架所述，植物健康不再仅由病原体缺失定义，而是由元生物体（meta-organism）内微生物稳态的维持来定义。因此，疾病越来越被解释为菌群失调（dysbiosis）的结果，即宿主与其相关微生物群之间平衡的破坏，而不仅仅是由于感染因子的存在[2]。这种生态学视角随后导致了病原生物组（pathobiome）概念的产生，Bass等人[3]将其定义为病原因子、共生微生物和宿主环境之间的复杂相互作用，表明感染从根本上是一个群落水平事件，而非单独攻击。将这种生态学视角应用于Vitis vinifera L.，葡萄藤现在被视为一个全生物（holobiont）。正如Zarraonaindia等人[4]的基础工作和Bettenfeld等人[5]进一步阐述的那样，该概念认为宿主植物及其相关微生物群（包括附生菌、内生菌和根际细菌）作为一个单一的、共同进化的生物单元发挥作用。这种关系延伸到遗传水平，描述为全基因组进化理论（hologenome theory of evolution）。Bordenstein和Theis[6]认为，自然选择的单位不是个体植物，而是全生物本身。宿主基因组和微生物组基因组协同进化。Trivedi等人[7]强调，这种微生物基因组为宿主提供了必需的功能性状，如固氮或耐旱性，并且植物在基因组上并未进化，从而在没有缓慢遗传突变的情况下有效扩展了其适应能力。
微生物特征和风土（terroir）的重要性
葡萄藤微生物组的意义远远超出了基本生存；它影响植物，影响生理活力和酿酒特性。Compant等人[8]强调，本地微生物群作为外部免疫系统，通过占据生态位和产生抗菌化合物提供针对生物胁迫的第一道防线，而Hassani等人[9]证明，微生物组对于养分获取也是不可或缺的，主动从土壤中挖掘磷和铁。在葡萄栽培的具体背景下，全生物在风土（terroir）表达中发挥关键作用，正如Bokulich等人[10]的开创性研究所证明的，并得到Knight等人[11]的支持。居住于果际（carposphere）的微生物群落具有独特的生物地理学特征。Belda等人[12]将其称为微生物风土（microbial terroir），证明这些特定的酵母和细菌群落直接影响发酵动力学和葡萄酒的最终感官特征，从而将土壤生物学与酒杯联系起来。
尽管对其重要性的认识日益增长，但葡萄藤全生物的结构仍然是可变的，并且对外部压力高度响应[6,8]。因此，本综述旨在综合当前关于葡萄藤全生物的知识，并解决先进基因组学与实际应用之间的关键差距。具体而言，研究人员专注于通过绘制从核心微生物组到病毒病原生物组的谱系来表征全生物的分类多样性，同时评估关键组装驱动因素（如宿主基因型和葡萄栽培管理策略（例如常规与有机））对群落组成的影响。最后，研究人员强调了从昂贵的下一代测序（NGS）到MALDI-TOF MS的方法学转变；正如Rahi等人[13]所指出的，这种蛋白质组学技术为监测可培养群落提供了快速且经济高效的替代方案，使微生物组信息化的葡萄栽培成为可持续生产的切实现实。
为了综合关于葡萄藤全生物的当前知识状态，使用Web of Science、Google Scholar、Scopus和PubMed等数据库进行了全面的文献检索。检索策略采用了关键词组合，包括“Vitis vinifera”、“holobiont”、“microbiome”、“synthetic microbial communities”、“MALDI-TOF MS”、“culture independent method”和“NGS”。主要选择2010年至2025年间发表的、与微生物组装驱动因素、植物-微生物相互作用以及葡萄栽培诊断进展相关的同行评审文章、综述和荟萃分析。排除了缺乏直接农业或酿酒学背景的研究。
2. 葡萄藤全生物的分类多样性
葡萄藤全生物的特点是具有非凡的系统发育多样性，涵盖所有生命领域的实体。正如Zarraonaindia等人[4]的基础宏基因组学研究所确立的那样，这种复杂组合并非随机分布；相反，它被组织成不同的生态位（根、叶和浆果），每个生态位都栖息着适应局部微环境条件的专门微生物群落。理解微生物组多样性的一个关键概念框架是稳定组分和可变组分之间的区别。Gobbi等人[14]将核心微生物组（core microbiome）定义为大多数葡萄藤样本共有的微生物分类群集合，无论地理位置如何。Campisano等人[15]的近期工作表明，这个核心通常包含假单胞菌属（Pseudomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）和甲基杆菌属（Methylobacterium）等属，提供进化上保守的功能，包括基本免疫调节和氧化应激保护。相比之下，Darriaut等人[16]认为，可变微生物组（variable microbiome）包含仅存在于特定环境中的分类群。这部分对土壤类型和气候条件等局部因素高度响应，并在植物的局部适应中发挥关键作用。最后，核心微生物组和可变微生物组之间的区别是由它们的生态角色驱动的。这些不同的角色直接塑造了它们的分类组成。核心功能的广泛存在意味着葡萄藤与其关键微生物之间存在强烈的共同进化。相比之下，宿主与可变微生物组之间的关系较为松散且更具机会性。
细菌是全生物内最丰富的功能群，在整个季节中表现出动态的群落变化。Barata等人[17]的测序分析揭示，革兰氏阴性变形菌门（Proteobacteria）在营养生长阶段占主导地位，而革兰氏阳性厚壁菌门（Firmicutes）在浆果成熟期间变得更加普遍。在功能上，这些生物中的相当一部分作为植物生长促进根际细菌（PGPR）发挥作用。根据Compant等人[18]的综述，假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）和伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）等属在促进固氮方面至关重要，而Pacifico等人[19]进一步鉴定了特定的内生放线菌（Actinobacteria），这些放线菌产生抗生素（例如链霉素类化合物），从而有助于植物的内部防御屏障。相反，该群落还包括专门的病原体，如植原体（phytoplasmas）（例如Candidatus Phytoplasma vitis）；Christensen等人[20]描述了这些无壁、韧皮部限制性细菌的独特生物学特性，强调它们能够操纵宿主的激素平衡以吸引叶蝉等昆虫媒介，从而导致系统性病害，如金叶病（Flavescence dorée）。
葡萄藤真菌组（mycobiome）表现出高度的空间和功能特化，范围从有益根共生体到浆果相关酵母。关于互惠相互作用，Trouvelot等人[21]强调了丛枝菌根真菌（AMF）（如Rhizophagus irregularis）的重要作用，它们扩展了根吸收磷和水分的表面积。Cameron等人[22]进一步证明，这种定殖引发了葡萄藤防御基因的启动，增强了对非生物胁迫的耐受性。相反，木质组织栖息着复杂的潜伏病原体群落，根据Mondello等人[23]和Hofstetter等人[24]的研究，与葡萄藤树干病害（GTDs）相关的真菌，如Phaeomoniella chlamydospora，可以在数年内无害地作为内生菌存在，直到干旱胁迫触发其致病性。最后，在酿酒学背景下，果际（carposphere）由酵母种群主导。Bokulich等人[25]证明，非酿酒酵母（non-Saccharomyces yeasts）（包括Hanseniaspora和Metschnikowia）的多样性是自发发酵的主要驱动因素，直接将葡萄园微生物组与葡萄酒的感官特征联系起来，并支持微生物风土（microbial terroir）的概念。
虽然历史上严格被视为病原体，但病毒组分越来越被认为是全生物的一个永久元素。Maree等人[26]强调了一种条件性互惠共生，其中诸如葡萄藤卷叶相关病毒（GLRaVs）等因子，尽管降低了产量，但在特定条件下可以诱导次级代谢产物（如花青素）的积累。此外，Al Rwahnih等人[27]使用高通量测序（HTS）揭示了许多葡萄藤携带无症状的孤儿病毒，这表明可能存在共生或互惠关系，正如Roossinck[28]所指出的，这可能包括赋予耐旱性。最近的高通量测序调查显示，葡萄藤病毒T（GVT）在葡萄园中广泛存在且高度可变，通常作为潜伏的无症状感染持续存在[29]。与此同时，Gómez等人[30]强调植物表观基因组的变化如何作为类病毒-宿主相互作用的新兴参与者，因为类病毒感染通过RNA沉默途径调节宿主基因表达。在机制上，这涉及类病毒衍生小RNA（vd-sRNAs）的产生，这些sRNA引导宿主Argonaute蛋白靶向内源宿主转录本，可能作为调节植物对环境胁迫抗性的调控元件。对感染核复制类病毒（如啤酒花矮化类病毒（HSVd）和葡萄藤黄斑类病毒1（GYSVd1））的葡萄藤组织进行深度测序，揭示vd-sRNA由多种Dicer样（DCL）酶产生，并源自受限的基因组热点，且负极性链的出现频率惊人，如Navarro等人[31]所证明。24-nt vd-sRNA的存在进一步表明，这些分子可能进入RNA指导的DNA甲基化途径以调节宿主基因表达。此外，Minoia等人[32]表明，特定的vd-sRNA被选择性加载到宿主Argonaute（AGO）蛋白（如AGO1、AGO2、AGO4和AGO5）中，主要基于其大小和5′-末端核苷酸，这一过程在体内主动减弱类病毒积累。从这些发现可以得出结论，类病毒可能影响植物对环境胁迫的抗性。除了感染植物的病毒外，葡萄藤木材还栖息着高度多样的真菌病毒组（mycovirome）。Debat等人[33]使用宏转录组学鉴定了与葡萄藤树干病害（GTDs）相关的真菌内部的许多新型真菌病毒。这些包括Botourmiaviridae和Mitoviridae家族的成员。这些真菌病毒可能关键地调节其真菌宿主的攻击性和致病性。
3. 葡萄藤全生物中的生态位
葡萄藤全生物并非同质实体；相反，它在空间上被组织成不同的生态位。正如Zarraonaindia等人[4]所证明的，微生物多样性沿着从土壤到叶片/浆果的垂直梯度下降，表明每个器官施加特定的选择压力，过滤群落组成。与葡萄藤全生物相关的关键微生物分类群，包括其主要生态位和功能角色，总结于表1。
内生圈（endosphere）指植物的内部组织，包括根皮层、木质部和叶肉，代表一个由宿主防御机制和物理屏障严格调控进入的生态位。当前模型提出了控制这种进入的两步选择过程。Bulgarelli等人[34]描述了根际面（rhizoplane）如何首先基于一般亲和力过滤土壤微生物，而根内皮层（endodermis）则作为选择性屏障。Compant等人[8]证实，这种屏障有效阻断了绝大多数土壤腐生菌，仅允许特定内生菌定殖，如Hardoim等人[35]所定义的，这些内生菌是对宿主不造成明显损害的微生物。一旦建立，这些内部定殖者对于系统健康至关重要。例如，Pacifico等人[19]强调，内生芽孢杆菌（Bacillus）和假单胞菌（Pseudomonas）菌株可以从内部调节植物的防御途径。然而，维管系统仍然是一个高风险区域，正如Deyett和Rolshausen[36]所指出的，木质部微生物组虽然通常由共生菌主导，但也作为潜伏维管病原体（如Xylella fastidiosa或葡萄藤树干病害真菌）的储库，只要生理应激触发其致病性，这些病原体可能保持休眠[23]。
叶际（phyllosphere）（叶片表面）代表一个恶劣、波动的环境，定殖者必须承受极端条件。Vorholt[37]强调，这些微生物面临高紫外线辐射、干燥和快速温度变化，迫使群落聚集在受保护的微位点，如气孔、毛状体或沿叶脉凹陷处。尽管存在这些严苛的限制，Pinto等人[38]发现，葡萄藤叶际维持着一个稳定的核心网络，该网络与通过风和雨暂时引入的物种相互作用。然而，Perazzolli等人[39]证明，这种本地叶际微生物群对化学和生物农业处理都具有高度抗性。由于这种强烈的本地稳定性和恶劣的环境暴露，引入的生物防治剂通常难以成功定殖和持续存在于该生态位中，因为它们必须与本地微生物激烈竞争有限的生存空间和养分。针对白Furmint品种的研究表明，幼叶、成熟叶片、花朵和葡萄串等地上植物器官共享一个真菌微生物组。真菌内生菌，如Aureobasidium pullulans、Cladosporium物种和Alternaria alternata复合体，强烈主导这些群落。此外，这些微生物的组成在邻近葡萄园之间缺乏显著的地理变异。因此，各个地上部分维持一个共同的中央真菌组。该群落的结构受特定植物器官和一年中的时间强烈影响，真菌定殖在秋季达到峰值[40]。
生殖器官（花序和浆果）代表短暂但关键的生态位，直接影响酿酒结果。花际（anthosphere）作为主要进入点。Compant等人[41]将花序确定为一个关键生态位，其中富含营养的花蜜吸引多种节肢动物。关键的是，Stefanini等人[42]提供了突破性证据，表明社会性黄蜂（如Vespa crabro）作为载体，在其肠道中运输酿酒酵母（Saccharomyces）细胞并将其沉积在葡萄花序和发育中的浆果上，从而确保发酵微生物群在冬季的连续性。随后，果际（carposphere）（浆果表面）经历剧烈变化。Martins等人[43]证明，在从坐果到转色期的过渡中，群落从变形菌门（Proteobacteria）主导转变为发酵准备的酵母谱。Barata等人[17]确认，可收获浆果上的最终微生物群落，由Hanseniaspora和Metschnikowia属物种主导，是花际中这些早期定殖事件的直接结果。除了这些高度特化的区室外，葡萄藤全生物的基础生态位是根际（rhizosphere），由于其作为中央枢纽的重要性，将在以下部分详细说明。
4. 根际作为葡萄藤全生物的功能枢纽
根际充当葡萄藤全生物的中央枢纽。根据Philippot等人[49]的定义，该区域是地球上最动态的界面之一，植物在此主动改造土壤环境。这一过程称为根沉积（rhizodeposition），涉及宿主投入其代谢能量的相当一部分，Vives-Peris等人[50]估计约11%的净固定碳——或高达分配至根的碳的27%——用于分泌渗出物以塑造周围微生物群落。历史上，根际研究侧重于编目微生物多样性，但Deyett和Rolshausen[36]强调，当前的科学焦点已转向功能分析。宏基因组学研究表明，虽然由于土壤异质性，葡萄园之间的分类组成可能有所不同，但功能性状——如参与养分循环和胁迫响应的基因——保持显著保守。Lemanceau等人[51]将这种现象描述为功能冗余（functional redundancy），这是一种安全机制，确保即使在特定微生物物种因环境波动而丢失时，全生物也能维持代谢稳定性。此外，Jousset等人[52]认为，低丰度分类群不仅仅是休眠的旁观者，而是遗传多样性的储库，可以在环境条件变化时迅速被激活以提供特定功能，如异生物降解。
根际微生物组的组装由复杂的化学对话驱动，其中植物分泌特定的糖、氨基酸和次级代谢产物混合物，作为化学引诱剂。Zhalnina等人[53]证明，这种泌出产生选择性压力，促进快速生长的变形菌门（Proteobacteria）生长，同时抑制缓慢生长的寡营养菌。除了普遍吸引，这种招募是高度特异性的；例如，Trouvelot等人[21]强调，葡萄藤在磷酸盐饥饿下分泌独脚金内酯（strigolactones）以专门招募丛枝菌根真菌（AMF）。此外，对话涉及复杂的模拟，如Venturi和Keel[54]所描述的，植物可以合成群体感应（Quorum Sensing）模拟物以有效修改细菌通信，从而协调定殖或破坏病原体毒力因子。近年来发现的最引人入胜的进化机制之一是胁迫介导的微生物组招募策略，其中Rolfe等人[55]提出，在感知到生物攻击或非生物胁迫时，植物主动改变其渗出物谱以招募特定的有益微生物。在葡萄栽培背景下，Marasco等人[56]提供了证据，表明干旱胁迫的葡萄藤在其根际富集了能够产生ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）脱氨酶的细菌。这种酶降低植物乙烯水平并减轻胁迫症状。Darriaut等人[16]证明，根渗出物可以类似地招募芽孢杆菌（Bacillus）菌株以诱导对土传病原体的系统抗性。关键的是，这种效应通过Bakker等人[57]引入的遗留效应（legacy effect）现象随时间持续存在，其中受胁迫的植物在土壤中留下保护性微生物足迹。这种具有抗性的土壤可以赋予种植在同一位置的下代葡萄藤更强的抗性，这一发现对受树干病害影响的葡萄园的补种策略具有深远意义。
5. 塑造葡萄藤全生物的因素
葡萄藤全生物的组装并非随机。它由确定性因素的层级结构控制。虽然Vandenkoornhuyse等人[58]提出了宿主-环境-管理框架，但Gobbi等人[14]最近的葡萄藤特异性荟萃分析表明，环境因素作为主要过滤器。相比之下，宿主基因型和管理实践作为群落组成的次级调节器。此外，Lemichez等人[59]发现，母藤与其营养后代之间的微生物遗传是弱且不一致的。这暴露了全生物框架中的一个关键局限性。种子繁殖的植物严重依赖垂直（亲代到子代）传播。然而，葡萄藤主要通过水平传播组装其微生物组。它们不断从土壤、环境和嫁接材料中招募微生物[4,14]。这种弱的世代联系对全基因组进化（hologenomic evolution）[6]具有深远影响。葡萄藤不依赖严格共同遗传的微生物谱系。相反，它们通过从周围环境获取动态基因库来适应[4,59]。因此，假设强垂直遗传的经典全基因组概念需要针对葡萄藤系统进行修改。在葡萄栽培中，全生物不是一个严格遗传的进化单位。它作为一个高度灵活、环境组装的元生物体（meta-organism）发挥作用[6,59]。微生物组装的主要驱动因素，包括宿主基因型、环境条件和人为管理实践，及其各自的影响，总结于表2。
宿主植物通过免疫信号和根泌出对其微生物组施加选择压力，产生由接穗和砧木驱动的不同效应。关于接穗，Migicovsky等人[60]证明，葡萄藤品种之间的遗传距离与其叶部微生物组的不相似性相关，而Pérez-Jaramillo等人[61]鉴定了不同品种选择参与碳水化合物代谢的特定细菌类群，这表明共同进化适应。在现代葡萄栽培中，根系通常属于不同物种（Vitis杂种），砧木基因型成为关键决定因素；Marasco等人[56]提供了关键证据，表明砧木显著影响根际群落，发现耐旱砧木（如1103 Paulsen）招募了更高丰度的ACC脱氨酶产生细菌。如Glick[62]所详述的，这种酶将ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）——乙烯的直接前体——裂解为α-酮丁酸和氨。这一机制有效抑制了乙烯生物合成途径，从而降低植物在干旱或盐胁迫反应中的乙烯水平，并维持逆境下的生长。此外，Berlanas等人[63]确认，即使接穗品种变化，这种砧木效应仍然持续，突出了根系作为微生物招募的主要界面。另一方面，环境作为微生物定殖的主要储库，通常覆盖遗传因素。Zarraonaindia等人[4]证明，土壤微生物组是葡萄藤细菌群落的最强预测因子，因为33%至48%的分类群在所有地下环境（包括根）中共享；具体而言，Burns等人[64]将土壤pH和C:N比确定为决定群落组装的关键土壤因子。Portillo等人[65]观察到显著的季节效应，其中降水和温度的年度波动比地理距离更剧烈地改变了浆果上的酵母群落结构。这支持了Bokulich等人[10]的发现，他们认为宏观气候条件印刻了特定的生物地理学特征，有助于区域葡萄酒典型性。然而，除了环境和气候影响外，人为干预也驱动葡萄园生态系统内微生物群落的重大变化，通常比自然生态过程更快速地诱导群落结构和多样性的改变。Lori等人[66]进行了一项全球荟萃分析，揭示常规管理显著降低了微生物丰富度和生物量。相比之下，Hendgen等人[67]发现，有机和生物动力系统支持更复杂的网络，真菌多样性（Shannon指数）更高，这一特征与更好的土壤病原体抑制能力相关。除了葡萄藤本身，葡萄园地表的管理同样关键。Chou等人[68]证明，使用覆盖作物增加了行间土壤的微生物连通性，促进有益昆虫和微生物向葡萄藤迁移。然而，病害管理带来了显著的权衡，Perazzolli等人[39]指出，频繁的杀菌剂施用诱导叶际菌群失调（dysbiosis）。在标准农业剂量（例如0.25 g/L）下，合成杀菌剂显著降低了总体细菌多样性和丰富度。系统性处理如嘧菌酯（azoxystrobin）通过严重耗尽厚壁菌门（Firmicutes）（一种对植物健康至关重要的门类）驱动了严重的内生圈菌群失调。此外，这些化学物质完全根除了组成群落不到1%的敏感稀有微生物分类群[69]。除了这些合成化学物质外，Brunetto等人[70]强调了有机葡萄园中长期铜积累的特定风险，表明高铜水平可能对有益根际细菌有毒，从而矛盾地降低土壤的长期自然肥力。这暴露了有机农业中的一个复杂悖论。根据Cesco等人[71]的观点，过量的铜积累逐渐降低土壤微生物生物量并破坏关键过程如固氮。此外，这种金属毒性对细菌群落的伤害比真菌群落更严重。建立通用毒性阈值仍然困难，因为欧洲国家使用不同的安全限值。在意大利，农业土壤的法定限值为200 mg/kg，而植物根中的临界毒性水平通常在100到400 mg/kg范围内。尽管存在这些严重的生态风险，铜对于防治葡萄藤真菌病害仍然必不可少。目前在有机葡萄栽培中缺乏可行的替代品。因此，现行法规严格限制纯铜施用量在7年期间不超过28 kg/ha，以减轻其环境影响[71]。
6. 微生物在健康与疾病中的功能
葡萄藤全生物处于动态平衡状态，在健康与疾病之间平衡，其功能状态由环境、宿主和管理因素的复杂相互作用塑造（图1）。根据Compant等人[8]的综述，这种功能库并非静态。它响应宿主生理和环境线索而波动，决定植物-微生物关系是保持互惠还是转向致病性。葡萄藤微生物组的很大一部分作为植物生长促进微生物（PGPMs）发挥作用，这些有益细菌和真菌提供基本的生态系统服务，增强葡萄藤的养分利用效率和胁迫耐受性。在养分循环方面，Rolli等人[72]证明，内生细菌如根瘤菌（Rhizobium）和固氮螺菌（Azospirillum）促进大气固氮并溶解无机磷。补充这一点，Mitter等人[73]强调了铁载体（siderophores）的作用，这些由有益微生物（如假单胞菌属Pseudomonas spp.）产生的铁螯合化合物从土壤中螯合铁，使其可供葡萄藤利用，同时剥夺土传病原体这一关键微量营养素。除了营养，这些微生物通过激素调节主动操纵植物发育。例如，假单胞菌属（Pseudomonas）、固氮螺菌属（Azospirillum）和芽孢杆菌属（Bacillus）的成员产生植物激素如吲哚-3-乙酸（IAA）和赤霉素，从而促进根生长和植物发育。此外，特定根际细菌（如B. licheniformis、P. fluorescens）可以诱导脱落酸（ABA）的积累和防御相关萜类的合成，这有助于延缓葡萄藤失水[74]。此外，正如Glick[62]所强调的，先前讨论的ACC脱氨酶产生细菌，特别是假单胞菌属（Pseudomonas spp.），通过降低植物乙烯水平在缓解非生物胁迫中发挥关键作用。
全生物中的疾病表达很少是单个病原体孤立作用的结果。它通常源于菌群失调（dysbiosis），即微生物群落的结构和功能崩溃。为了理解这种动态，必须通过三种不同的生态途径区分菌群失调与感染之间的因果关系[1,2]。首先，原发性病原体诱导的疾病发生在高度毒力的因子（如Plasmopara viticola）成功入侵并主动压倒健康微生物组时，这意味着菌群失调是感染的结果。其次，疾病可能主要源于群落失稳，其中严重的环境胁迫（如极端天气或化学过度施用）削弱了共生网络，从而使植物容易受到广泛的一般性感染[2]。第三，对全生物框架最独特的是，病原生物（pathobionts）（如葡萄藤树干病害真菌）的特定作用，它们在群落破坏后严格地从共生过渡到毒力[3,5]。许多致病因子作为机会性病原体存在，在正常条件下无害或潜伏。Hofstetter等人[24]报道，健康葡萄藤携带高度多样化的木材定殖真菌（如Phaeomoniella、Phaeoacremonium）而无症状。相反，Bettenfeld等人[5]认为，这些生物只有在抑制性共生群落被破坏时才过渡到致病生活方式。从潜伏到毒力的转变通常由环境胁迫触发。Bulgari等人[75]观察到，植原体感染（如金叶病Flavescence dorée和黑木病Bois noir）重构了内生细菌群落，导致菌群失调。Mondello等人[23]进一步解释，这种转变通常涉及群体感应（Quorum Sensing），这是一种化学通信系统，病原体在其种群密度达到临界阈值时协调攻击。
本地微生物组作为第一道防线，提供Berg等人[76]所称的扩展免疫（extended immunity）。在直接相互作用方面，Pertot等人[77]描述了生物防治剂（BCAs）如何积极竞争空间和养分以抑制病原体。有益根际细菌和内生菌的应用提供了多方面的病害控制方法，根据Compant等人[78]的研究，包括假单胞菌属（Pseudomonas）、芽孢杆菌属（Bacillus）、伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia）和链霉菌属（Streptomyces）在内的不同属部署了诸如抗生素作用、资源竞争、干扰病原体信号和降解病原体毒力因子等机制。例如，特定有益细菌对植物毒素和草酸的降解显著降低了真菌树干病害和灰霉病的症状严重程度。超越物理接触抑制，Lazazzara等人[79]发现，葡萄藤相关细菌（如Brevibacillus）释放挥发性有机化合物（VOCs）。这些空气传播的分子可以在远距离抑制病原体如灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola）的菌丝生长，从而有效抑制病原体。然而，也许最复杂的机制是启动植物自身的免疫系统。Trotel-Aziz等人[80]提供了证据，表明根际中的有益细菌通过激活茉莉酸和乙烯信号通路触发诱导系统抗性（ISR），从而使枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等微生物准备好葡萄藤以更快速响应后续攻击。补充这一点，Ty?kiewicz等人[81]综述了木霉属（Trichoderma）真菌的作用，指出它们具有寄生致病真菌同时直接激活宿主防御基因的双重能力。在此基础上，直接从葡萄藤木质组织中分离的特定内生木霉物种，如T. afroharzianum和T. simmonsii，已显示出对主要葡萄藤树干病害病原体的出色体外生物防治活性[82]。此外，用这些内生木霉菌株进行种植前根部处理会导致长期的全株定殖，并显著提高葡萄藤的萌芽率和萌芽活力指数[83]。
7. 葡萄藤全生物诊断的进展
葡萄藤微生物学的研究长期基于培养依赖方法。虽然这些技术对于获得用于下游生理测试（如体外拮抗试验）和SynCom开发的活体分离物仍然必不可少，但其适用性受到一个主要瓶颈的限制。在环境微生物学中，一个广泛接受的范式是标准平板培养技术仅捕获约1%的总体微生物多样性[84]。因此，绝大多数微生物仍然未被培养。然而，正如Schultz等人[85]所指出的，关于可培养部分的确切百分比没有普遍共识，因为它高度依赖于特定的微生物组和所研究的环境。然而，在嗜极生物的情况下，这确实低于1%，最近大约80-85%的微生物分类群通常被称为微生物暗物质（microbial dark matter），缺乏培养代表物。先进培养技术的持续发展显著提高了回收率，允许在某些情况下可培养部分达到15-20%[85]。尽管有这些进展，仍有相当一部分由于特定的营养需求或活但不可培养（VBNC）状态而未被检测到，留下了绝大多数群落未被发现[38]。
为了克服这一不足，过去十年见证了下一代测序（NGS）的兴起，特别是16S rRNA和ITS元条形码，用于鉴定细菌和真菌群落。Deyett和Rolshausen[36]强调，NGS通过揭示全生物的深刻复杂性，每样本鉴定数千个分类群，彻底改变了该领域。然而，NGS并非没有关键局限性。Carini等人[86]证明，基于DNA的方法通常无法区分活细胞和来自死微生物的残留DNA，导致多样性被高估高达40%。具体而言，土壤中的残留DNA可能严重模糊微生物群落的时空动态。Carini等人[87]证明，中和这种细胞外遗传物质对于准确追踪季节性微生物组变化至关重要。这可以通过在DNA提取前用光反应性单叠氮丙啶（PMA）处理样品来有效实现。为了进一步克服短读长NGS的局限性，研究人员现在利用PacBio等长读长测序技术。Jin等人[88]成功直接从葡萄藤叶际重建了高质量的宏基因组组装基因组（MAGs）。这种方法深入揭示了与次级代谢和抗菌素耐药性相关的功能基因。此外，Pollock等人[89]警告了PCR扩增偏差可能扭曲群落谱。最后，如Pinto和Gomes[90]所指出的，NGS的高成本和生物信息学负担使其不太适合农业实践中的常规大规模监测。
在此背景下，基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已成为一种变革性技术，有效弥合了传统培养与分子诊断之间的差距。与基于PCR的方法需要耗时的DNA提取不同，MALDI-TOF MS基于其独特的蛋白质指纹图谱鉴定微生物。必须强调的是，该方法主要检测核糖体蛋白，并且严格需要纯分离物才能进行可靠的数据库匹配。因此，虽然极其快速（通常<1分钟/样本）且成本效益高[91]，MALDI-TOF MS本质上受其绝对依赖于培养技术的限制；它无法从复杂环境样品中检测到不可培养或VBNC生物。Rahi等人[13]认为，这种效率允许对数千个培养依赖分离物进行高通量筛选，这对于捕获与植物健康相关的微生物组活性部分至关重要。该技术在区分与酿酒学密切相关的近缘物种方面特别强大，正如Usbeck等人[92]所证明的，他们在区分从葡萄中分离的酵母物种（如酿酒酵母Saccharomyces与非酿酒酵母non-Saccharomyces）时达到了68.1%的准确率。最近，Ka?ániová等人[93]利用该技术绘制了不同气候区葡萄浆果的微生物群，证明了其在风土研究中的实用性。此外，Zhang等人[94]的近期研究表明，MALDI-TOF MS是实时监测野生发酵过程中酵母多样性和动态的理想工具，为种植者提供NGS无法以相同速度传递的可操作数据。重要的是，NGS和MALDI-TOF MS应被视为高度互补的方法，而非相互排斥的替代方案。虽然NGS对于直接从环境样品中提供深入的群落水平分类学见解不可或缺[36]，但MALDI-TOF MS非常适用于对可培养部分进行快速、高通量鉴定[13,91]。整合这两种技术允许研究人员使用测序全面绘制总多样性，同时为下游生理测试和