《SCIENCE ADVANCES》：Reassessing the role of progesterone receptor isoforms PGR-A and PGR-B in female fertility
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孕酮是一种关键的生殖激素，通过孕酮受体（PGR）转录调控因子发挥作用。较短的PGR-A亚型缺少存在于PGR-B中的164个氨基酸的氨基末端区域，该区域显著增强转录活性。特异性失活PGR-A（PRAKO）或PGR-B（PRBKO）的亚型特异性突变体表明，PGR-
孕酮是一种关键的生殖激素，通过孕酮受体（PGR）转录调控因子发挥作用。较短的PGR-A亚型缺少存在于PGR-B中的164个氨基酸的氨基末端区域，该区域显著增强转录活性。特异性失活PGR-A（PRAKO）或PGR-B（PRBKO）的亚型特异性突变体表明，PGR-A对雌性生育力至关重要。本研究通过显示PRAKO中一个意外的移码突变导致两种亚型均被消除，而非预期的PGR-A亚型特异性突变，从而修正了这一解释。通过CRISPR-Cas9编辑产生的真正PGR-A特异性突变体，完全缺乏PGR-A但保留了PGR-B表达，其表型与野生型无法区分。因此，虽然较短的PGR-A亚型具有独特功能，但它对小鼠雌性生殖并非独立必需，这些高度保守的亚型的生理作用必须根据这一新信息重新考虑。
孕酮（Progesterone）通过孕酮受体（PGR，一种激素响应性转录因子）调控生殖功能，PGR存在两种主要亚型：PGR-A和PGR-B。PGR-B在N端多出164个氨基酸，包含激活功能3结构域，使其转录活性显著强于PGR-A。过去20余年，基于PRAKO（PGR-A特异性敲除）和PRBKO（PGR-B特异性敲除）小鼠模型的研究认为，PGR-A对雌性排卵和生育力至关重要，而PGR-B并非必需。然而，该结论存在争议，因为PRAKO小鼠的颗粒细胞转录组与完全PGR敲除（PRKO）小鼠高度相似，且缺乏PGR-A功能独立的直接机制解释。本研究旨在重新评估PGR-A和PGR-B在雌性生育力中的具体作用，纠正先前因基因编辑意外引入移码突变导致的错误认知。
研究人员利用CRISPR-Cas9技术生成了真正的PGR-A特异性突变小鼠（PGR-Amut），并通过Western blot、免疫荧光、RNA测序（RNA-seq）、组织学分析及生育力评估等方法，系统比较了PGR-Amut与野生型（WT）、PRKO、PRAKO及PRBKO小鼠的表型和基因表达差异。该研究揭示了PGR-A并非独立维持雌性生育力的必需因子，而是与PGR-B功能冗余。论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。
主要关键技术方法包括：①CRISPR-Cas9基因编辑（含pegRNA和单链DNA修复模板）生成PGR-A特异性突变小鼠；②Western blot和免疫荧光检测PGR亚型蛋白表达（使用pan-PGR抗体D8Q2J、PGR-B特异性抗体C1A2等）；③RNA-seq分析颗粒细胞转录组（Illumina NovaSeq 6000平台，差异表达基因以log2倍数变化≥1且校正P≤0.01为阈值）；④组织学检查（苏木精-伊红染色）和免疫荧光染色（Ki67、NR2F2等）评估子宫和卵巢形态；⑤生育力评估包括排卵计数（人绒毛膜促性腺激素刺激后16小时）、交配实验（记录产仔数、妊娠期、幼崽体重）。样本来源：小鼠品系（PRKO、PRAKO、PRBKO）购自Jackson Laboratory，PGR-Amut由南澳大利亚基因组编辑中心在C57BL/6背景下生成，所有动物饲养于阿德莱德大学实验动物中心。
**结果部分：**
**PGR-A突变小鼠模型中两种PGR蛋白亚型均检测不到**
通过Western blot和免疫荧光发现，原PRAKO小鼠的子宫和颗粒细胞中不仅缺乏PGR-A，也无法检测到PGR-B，而存在一个22 kDa的截短蛋白片段。Sanger测序揭示PRAKO的PGR-A起始密码子附近存在一个意外的单碱基缺失，导致移码突变，在PGR-B起始位点下游45个氨基酸处引入提前终止密码子，从而破坏两种亚型的翻译。该移码突变在基因分型时因NheI酶切位点保留而被忽视。
**生成真正的PGR-A亚型特异性突变小鼠**
利用CRISPR-Cas9技术，将PGR-A起始密码子ATG突变为GCT，并引入沉默突变建立NheI酶切位点。通过显微注射受精卵和胚胎移植，获得三个独立 founder 品系。Western blot验证显示，PGR-Amut小鼠的子宫和颗粒细胞中PGR-A完全缺失，但PGR-B正常表达，无截短片段，确认了特异性敲除。
**PGR-A亚型特异性突变小鼠排卵正常**
对三个 founder 品系的雌性小鼠进行促性腺激素刺激，统计排卵数（卵丘-卵母细胞复合体，COCs）。PGR-Amut纯合子平均排卵39个，与WT（22个）和杂合子（37个）无显著差异（P>0.05）。卵巢组织学显示所有基因型均形成正常黄体，无排卵失败迹象。RNA-seq分析显示，PGR-Amut颗粒细胞与WT相比仅有极少数差异表达基因（主要为非编码RNA），且与PRKO的差异基因表达模式不一致。主成分分析表明，PGR-Amut和PRBKO的转录组与WT无法区分，而PRKO和PRAKO聚在一起，说明只有同时缺失两种亚型才导致显著转录组改变。
**PGR-Amut小鼠子宫和乳腺形态正常，雌性生育力正常**
子宫组织学显示，PGR-Amut的子宫腔上皮、腺体和基质形态与WT无异，而PRKO则呈现典型的增生性腔上皮和肥大腺体。免疫荧光显示PGR-Amut子宫中PGR-B和总PGR正常表达，增殖标志物Ki67和PGR靶基因NR2F2表达正常。生育力评估中，PGR-Amut纯合子雌性与WT雄性交配后，产仔数、妊娠期、幼崽21日龄体重均与WT无显著差异（P>0.05）。乳腺整体形态和泌乳功能（通过幼崽胃中可见乳汁和体重增长判断）也正常。
**讨论与结论：**
本研究发现，虽然分子证据支持PGR亚型间存在功能差异（如PGR-B转录活性更高、辅因子互作不同、调控基因集不同），但从整体生理学角度看，单个PGR亚型的功能在很大程度上是冗余的。PGR-A特异性突变小鼠的表型与WT不可区分，与PGR-B特异性突变小鼠的报道一致。因此，先前关于PGR-A在雌性生育力中具有独立关键作用的结论需要修正，这一错误源于PRAKO小鼠模型中的意外移码突变导致两种亚型均缺失。本研究为PGR亚型功能提供了新的有效模型，并重新开启了探索PGR亚型在非生殖组织（如乳腺癌）中差异功能的研究方向。
**研究结论：** 研究人员发现，尽管分子证据支持PGR亚型间存在功能差异，包括PGR-B更高的转录活性、较少的辅因子互作重叠以及不同的调控基因集，但从整体生理学角度看，每个单独PGR亚型的功能在很大程度上是冗余的。新的PGR-A特异性突变小鼠模型证实其表型与WT小鼠不可区分，与PGR-B特异性突变体的报道一致。这一新的PGR-A突变模型可能有助于未来研究在非生殖组织或疾病背景（如乳腺癌）中发现PGR亚型的差异功能。
