使用种子扩增法检测脑和脑脊液中的TDP-43蛋白病

《Current Issues in Molecular Biology》：Detection of TDP-43 Proteinopathies in Brain and Cerebrospinal Fluid Using Seed Amplification Assay

　　

错误折叠的TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的主要病理标志。尽管种子扩增试验（SAAs），如实时震动诱导转化（RT-QuIC），在检测脑脊液（CSF）和嗅黏膜中的错误折叠TDP-43方面显示出前景，但仍迫切需要技术上可行的、适用于广泛临床应用的方法。研究人员开发了一种简化的、非免疫沉淀的TDP-43 RT-QuIC检测方法，用于评估脑组织和CSF中的播种活性。研究人员利用来自TDP-43蛋白病患者和对照受试者的CSF评估了其诊断性能，并进一步检查了其与神经丝轻链（NfL）和tau相关生物标志物的关联。在CSF分析中，该检测方法在70%（21/30）的ALS伴痴呆患者、50%（5/10）的FTLD患者和40%（8/20）的单纯ALS患者中显示出阳性播种活性。该检测方法表现出优异的特异性，在>99%（199/200）的对照样本中产生阴性结果，包括那些具有自身免疫或电生理异常的样本。此外，CSF分析显示，与SAA阴性病例相比，TDP-43 SAA阳性病例的NfL水平显著升高（p < 0.0008）。在SAA阳性的ALS伴痴呆和ALS队列中观察到最高的NfL浓度，而FTLD中的水平较低。tau相关生物标志物在组间未显示出显著差异。研究人员简化的、非免疫沉淀的TDP-43 RT-QuIC检测方法能够高度特异性地检测病理性TDP-43播种活性。尽管该检测方法检测的是潜在的TDP-43蛋白病，而非区分ALS和FTLD临床表型，但其技术简单性以及与NfL测量的联合应用为生物标志物开发提供了稳健、可扩展的框架。该方法为未来的多中心验证和国际标准化工作提供了实用基础。

TDP-43蛋白病是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶变性（FTLD）的核心病理特征，约97%的ALS和45%的FTLD病例存在TDP-43病理。错误折叠的TDP-43可以以朊病毒样方式在细胞间传播，这为利用种子扩增试验（SAAs）检测提供了理论基础。然而，现有SAAs方法在重复性和标准化方面存在局限，限制了临床转化。研究者旨在建立一种简化、非免疫沉淀的实时震动诱导转化（RT-QuIC）检测方法，以检测脑组织和脑脊液（CSF）中的病理性TDP-43播种活性，并评估其与神经丝轻链（NfL）等生物标志物的关联，为TDP-43蛋白病的临床诊断提供可扩展的检测平台。该研究发表在《Current Issues in Molecular Biology》。

研究者采用的主要关键技术方法包括：利用重组人TDP-25（220-414）片段与SUMO标签融合作为底物，优化RT-QuIC反应条件（温度、缓冲液pH、硫黄素T浓度、震荡模式）；使用脑组织匀浆（来自尸检证实的TDP-43阳性FTLD和ALS患者）进行方法优化，并采用Spearman–K?rber法计算50%播种剂量（SD₅₀）；将优化后的方法应用于CSF样本（来自38例TDP-43蛋白病患者和200例对照，样本来源于佐世保综合医院和长崎北医院，2017-2024年间回顾性收集），检测播种活性并分析NfL及tau相关标志物水平。

**3.1 脑组织中的TDP-43检测**
通过RT-QuIC检测，TDP-43阳性FTLD患者脑匀浆中硫黄素T（ThT）荧光快速上升并达到持续平台；而TDP-43阳性ALS患者脑匀浆呈现出初始荧光立即升高随后逐渐下降的非典型动力学曲线；对照脑样本保持低平基线。该结果证明脑组织中的TDP-43播种活性可通过动力学特征区分疾病类型。

**3.2 脑组织TDP-43检测的SD₅₀分析**
对4例脑匀浆（2例TDP-43 ALS、2例FTLD）进行log SD₅₀分析，ALS病例的SD₅₀值分别为7.91±0.15和7.39±0.83，FTLD病例分别为6.93±0.52和7.11±0.73，表明脑组织中播种活性水平相当。

**3.3 CSF样本中的TDP-43检测**
优化后的RT-QuIC在CSF中成功检测到病理TDP-43播种活性，并重现了脑组织中观察到的疾病特异性动力学模式：ALS患者CSF（包括伴痴呆和不伴痴呆）呈现快速初始峰随后下降，FTLD患者CSF呈现快速上升至持续平台。在临床队列中，检测阳性率：ALS伴痴呆70%（21/30），单纯ALS 40%（8/20），FTLD 50%（5/10）；对照样本特异性99.5%（199/200阴性），仅1例肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）抗体阳性重症肌无力患者出现假阳性。该结果验证了CSF直接检测TDP-43蛋白病的高灵敏度和特异性。

**3.4 CSF中神经丝轻链和总tau蛋白水平**
分析显示，SAA阳性病例的CSF NfL水平显著高于SAA阴性病例（p < 0.0008）。SAA阳性ALS伴痴呆组NfL最高（均值15497.76 pg/mL），其次为SAA阳性ALS组（12472.46 pg/mL），而SAA阳性FTLD组NfL较低（8964.00 pg/mL），与SAA阴性各组水平相当。tau相关标志物（总tau、磷酸化tau、p-Tau/t-Tau比值）在SAA阳性和阴性组间无显著差异。该结果提示NfL可作为TDP-43播种活性的伴随生物标志物，而tau标志物不具区分价值。

讨论部分总结：研究者成功建立了以TDP-25-SUMO标签为底物的简化RT-QuIC方法，规避了全长度TDP-43自发聚集难题，并能直接检测CSF中极低浓度的病理种子。该方法避免了免疫沉淀步骤带来的批次间变异和成本增加，具有良好的可扩展性。ALS和FTLD样本间不同的荧光动力学特征支持TDP-43聚集体的构象株假说，与冷冻电镜研究一致。NfL水平升高主要反映ALS中运动轴突的广泛变性，而非FTLD的皮质受累。研究局限性包括样本量较小（60例）、未进行多变量校正（年龄、性别）以及缺乏遗传学筛查数据。未来方向包括优化灵敏度（如胶束辅助SAAs）、探索外周组织（如嗅黏膜）检测、以及利用动力学特征区分ALS和FTLD临床表型，并扩展应用于年龄相关的边缘系统TDP-43脑病（LATE）检测。

研究结论部分翻译：本研究证明，使用经TDP-25-SUMO标签底物优化的简化RT-QuIC方法，成功检测到CSF和脑样本中的错误折叠TDP-43聚集体。这些发现为基于CSF的TDP-43种子扩增试验的临床应用提供了强有力的概念验证。尽管当前方法可靠地确认了广泛的TDP-43蛋白病，但未来进一步提升区分特定疾病表型的能力将最终最大化这一创新生物标志物平台的临床和治疗效用。