直接细菌转录本可视化揭示结核分枝杆菌在肺部的时空环境适应

《SCIENCE ADVANCES》：Direct bacterial transcript visualization illuminates spatiotemporal environmental adaptation of Mycobacterium tuberculosis in the lung

　　

时空环境变异导致细菌感染进展和疾病结局的显著异质性，对治疗成功具有重要影响。对于全球重要病原体结核分枝杆菌（Mtb），尽管病灶免疫细胞组成和表型的显著宿主内空间异质性已被充分描述，但高度复杂的Mtb细胞包膜对所需的对细菌异质性的同等洞察构成了特殊挑战。在此，研究人员开发了基于杂交链式反应-荧光原位杂交（HCR-FISH）的方法，用于在完整肺和病灶结构背景下实现Mtb mRNA的可视化。结合Mtb转录/翻译活性报告基因，研究人员揭示了与Mtb脂质代谢、关键环境信号应答以及ESX-1型Ⅶ型分泌系统相关的基因表达的时空差异。研究结果建立了Mtb mRNA原位分析的框架，为阐明Mtb-宿主相互作用显著异质性背后的关键细菌驱动因素开辟了道路。

**论文解读：直接细菌转录本可视化揭示结核分枝杆菌在肺部的时空环境适应**

**研究背景与存在问题**

结核病（Tuberculosis, TB）仍是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的全球首要传染病死因。感染过程中，宿主环境的时空变化（包括适应性免疫启动、局部免疫细胞组成差异等）导致细菌感染进展和疾病结局的显著异质性，直接影响治疗效果。近年来，空间转录组学、迭代蛋白质/原位杂交成像及质谱成像等方法揭示了Mtb感染病灶（肉芽肿）内宿主细胞类型、免疫应答及代谢状态的显著空间差异。然而，由于Mtb具有高度复杂的细胞包膜（包括外层荚膜样结构、分枝菌酸、阿拉伯半乳聚糖、肽聚糖及脂阿拉伯甘露聚糖层），标准渗透方法难以有效穿透，导致无法在单细菌水平上直接检测Mtb mRNA，阻碍了对细菌在组织背景下适应性响应的等同理解。此前，荧光报告菌株虽提供了初步空间信息，但受限于质粒稳定性、时间点限制及通量，而基于FISH的方法在厚细胞壁细菌（如Mtb）中面临探针进入困难的技术瓶颈。因此，开发一种能够直接在完整组织病灶中定量检测Mtb mRNA的方法，对于阐明Mtb宿主内空间适应性机制及优化治疗策略至关重要。

**研究目的与开展的研究**

本研究旨在建立一种基于杂交链式反应-荧光原位杂交（HCR-FISH）的方法，以在完整肺组织及病灶结构背景下，以单细菌分辨率直接检测Mtb转录本。研究人员利用C3HeB/FeJ小鼠模型（该模型可重现人感染中标志性坏死性病灶类型），聚焦Mtb感染过程中的三个关键方面：脂质利用、一氧化氮（NO）/低氧暴露以及ESX-1型Ⅶ型分泌系统功能。通过分析感染后2周、6周和16周三个时间点，并结合Mtb转录/翻译活性报告菌株（doxycycline诱导型mKO报告基因），研究人员系统考察了Mtb在不同病灶亚区域（巨噬细胞丰富的袖套区、中性粒细胞丰富的核心边缘及坏死核心中心）的基因表达时空变化。

**主要关键技术与方法**

1. **HCR-FISH方法建立**：针对Mtb mRNA检测，开发了逐步渗透处理程序，依次使用淀粉酶、支链淀粉酶、SDS、蛋白酶K、无色肽酶、盐酸、重组海藻糖二霉菌酸酯水解酶（TDM hydrolase）、分枝杆菌噬菌体蛋白溶菌素B（lysin B）及溶菌酶，系统破坏Mtb细胞包膜的各个层次（多糖、脂质、蛋白质、分枝菌酸、肽聚糖），随后进行探针杂交和荧光信号放大。
2. **Mtb转录/翻译活性报告菌株**：使用染色体编码的doxycycline诱导型mKO（monomeric Kusabira Orange）报告菌株，同时组成型表达mCherry，用于标记所有细菌并反映细菌活性。
3. **小鼠感染模型**：采用C3HeB/FeJ小鼠，经鼻内感染Mtb，在感染后2、6、7、13、16、17周处死，取肺组织固定、包埋、切片。
4. **共聚焦显微镜成像与定量分析**：通过激光共聚焦显微镜获取三维图像，利用Volocity软件对细菌进行分割和信号强度定量，计算信号/μm3，并归一化背景。

**研究结果**

**1. Mtb转录/翻译活性在坏死病灶内随感染进展而降低**
利用doxycycline诱导型mKO报告菌株，研究人员发现：在6周感染时，核心边缘的Mtb具有高转录/翻译活性，而袖套区Mtb活性较低；12周时病灶间异质性增加，部分病灶仍保持6周模式，部分病灶活性下降；16周时，无论核心边缘还是袖套区，Mtb活性均显著降低，且变异系数减小。结论：随着病灶成熟，Mtb转录/翻译活性下降，核心边缘环境对细菌复制的支持减弱。

**2. 适应HCR-FISH检测Mtb体内转录本**
通过逐步渗透处理，成功检测到Mtb 16S rRNA和mRNA转录本。处理不仅增强了16S rRNA信号，还提高了Mtb杆菌的检出率。研究人员将病灶分为三个亚区域：袖套区（巨噬细胞为主）、核心边缘（中性粒细胞为主）和核心中心（细胞外Mtb），以及非坏死性巨噬细胞丰富病灶。

**3. Mtb脂质利用基因的时空表达变化**
针对脂质应答基因簇rv3160c-rv3162c进行检测：2周时，97.6%的Mtb无或低表达；6周时，袖套区和核心中心Mtb表达显著升高（25.9%和22.3%处于中高水平），但核心边缘Mtb表达较低（23.2%无检测信号）；16周时，所有亚区域Mtb表达均升高，且核心边缘与袖套区差异消失。非坏死性病灶中Mtb表达低于坏死性病灶袖套区。结论：随着坏死病灶形成，Mtb从非脂质环境向脂质丰富环境转变；核心边缘早期脂质暴露较少，后期趋于一致。

**4. 一氧化氮/低氧早期应答基因在袖套区和核心边缘上调**
针对hspX操纵子（rv2028c-rv2031c，NO/低氧应答标记）进行检测：2周时已有9.5%的Mtb无检测信号，且检测到宿主Nos2表达；6周时，袖套区45.8%的Mtb表达中高水平hspX，核心边缘更高（30.3%高表达），核心中心表达极低（4.7%高表达）；16周时，袖套区与核心边缘的高表达百分率趋向一致，核心中心仍低。非坏死性病灶中Mtb高表达比例低于坏死性病灶袖套区。结论：Mtb在感染早期即暴露于NO相关应激；核心边缘环境（中性粒细胞产生NO并消耗氧）导致更强的hspX表达，但核心中心持续缺氧可能使hspX表达下调。

**5. ESX-1型Ⅶ型分泌系统效应基因在巨噬细胞中表达最强且随时间下降**
针对espACD操纵子（rv3614c-rv3616c，ESX-1分泌底物）进行检测：2周时大部分Mtb已有表达；6周时，袖套区表达最强（45.5%中高水平），核心边缘和核心中心表达显著较低（21.5%和17.9%）；16周时，袖套区表达有下降趋势，但未达统计学显著；核心边缘和核心中心仍低。非坏死性病灶与坏死性病灶袖套区表达相似。结论：ESX-1系统在Mtb驻留于巨噬细胞时尤为重要，表达随感染进展呈下降趋势。

**总结讨论与结论**

本研究通过建立HCR-FISH方法，首次在单细菌分辨率下直接可视化Mtb mRNA在完整肺组织病灶中的空间表达。研究揭示了Mtb在脂质代谢、NO/低氧应答及ESX-1分泌系统三方面的显著时空异质性，并指出巨噬细胞与中性粒细胞微环境对Mtb生理状态的差异化影响。这些发现为理解Mtb感染异质性的细菌驱动因素提供了关键框架，并表明在治疗设计时必须考虑时空变化，特别是针对慢性结核病，疗法需有效作用于已建立的感染。该方法可扩展至其他难以渗透的细菌（如肺炎链球菌、艰难梭菌），并有望直接应用于患者组织样本，为空间异质性在感染性疾病中的作用研究开辟新途径。