GNPs-pIL-4重编程巨噬细胞极化并激活OSM/GSNOR/ENG轴以改善缺血肢体的血管生成

《SCIENCE ADVANCES》：GNPs-pIL-4 reprograms macrophage polarization and activates the OSM/GSNOR/ENG axis to improve angiogenesis in ischemic limbs

　　

基于基因疗法的治疗性血管生成是一种潜在的外周动脉疾病（PAD）治疗方法，但需要更稳定、高效、高亲和力的递送载体和优化的递送策略。研究人员设计了经叶酸和聚乙烯亚胺修饰的三维石墨烯纳米颗粒，用于巨噬细胞特异性递送白细胞介素-4质粒（pIL-4），形成GNPs-pIL-4用于局部肌肉注射。GNPs-pIL-4具有均匀的尺寸、正表面电荷和强大的核酸负载能力（解离常数K_d：25纳摩尔）。在体内，GNPs-pIL-4通过诱导修复性M2型巨噬细胞极化重塑了缺血微环境。通过巨噬细胞介导，GNPs-pIL-4改善了肌肉收缩力，延缓了力量丧失，并增强了血液灌注和氧饱和度。机制上，GNPs-pIL-4特异性地启动了制瘤素M（OSM）介导的巨噬细胞-内皮细胞通讯，进而激活了血管生成，增加了内皮出芽、迁移和管状形成。这些效应归因于下调的S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）表达，从而增加了内皮糖蛋白（ENG）C209位点的S-亚硝基化。GNPs-pIL-4代表了一种有前景的PAD基因治疗策略。

**研究背景、问题及研究目的**
外周动脉疾病（PAD）是一种因动脉狭窄或闭塞导致的慢性缺血性疾病，全球超过2.3亿成年人受累，其中重症肢体缺血患者1年死亡率达25%–35%，截肢率高达30%，5年无截肢生存率仅27.1%。现有疗法（如血运重建、抗血小板治疗和运动康复）虽能缓解症状，但难以有效恢复微血管灌注和促进组织再生。基于基因疗法的治疗性血管生成是潜在策略，但外源性递送单一促血管生成因子（如血管内皮生长因子VEGF、成纤维细胞生长因子FGF）常导致不成熟和渗漏的血管，且缺血微环境在血管生成中发挥双重作用——既启动过程又决定新血管的结构和功能完整性。因此，需要干预措施重塑局部微环境以增强再灌注和再生。巨噬细胞在缺血微环境中从促炎M1型向修复性M2型极化是关键的调节事件，但M1过度激活或M2不足会破坏免疫稳态并加剧PAD进展。白细胞介素-4（IL-4）是经典的M2极化诱导剂，但其蛋白半衰期短、易降解，需高频大剂量给药，且可能引发过敏反应或肿瘤免疫逃逸。基因递送可实现持续表达，但病毒载体存在整合风险和免疫原性，非病毒载体缺乏细胞特异性。石墨烯纳米颗粒因大比表面积、膜穿透能力和可修饰性成为有前景的核酸递送平台，但用于PAD血管生成的研究尚不足。此外，一氧化氮（NO）通过S-亚硝基化调节内皮功能，而S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）维持该修饰平衡，但其在肢体缺血中的角色未知。本研究旨在开发一种基于石墨烯纳米颗粒的IL-4质粒递送系统（GNPs-pIL-4），以重塑局部微环境、靶向重编程巨噬细胞并增强缺血组织再生，并探索其机制。

**研究内容与结论**
研究人员成功构建了经叶酸和聚乙烯亚胺修饰的三维石墨烯纳米颗粒（GNPs），用于巨噬细胞特异性递送IL-4质粒（pIL-4），形成GNPs-pIL-4。该体系具有均匀尺寸（~168.5 nm）、正表面电荷（+41.9 mV）和强核酸结合能力（K_d ~25 nM），血清稳定性达4天，在模拟巨噬细胞酸性环境中持续释放DNA。小鼠后肢缺血（HLI）模型中，GNPs-pIL-4显著提升IL-4蛋白表达，并选择性诱导M2a型巨噬细胞极化（上调Arg1、Mrc1，下调Cd80、Nos2），同时增加M2相关细胞因子（IL-4、IL-10）并减少M1相关因子（TNF-α、CCL3）。单细胞RNA测序证实M2标志物Mrc1升高、M1标志物CD86降低。在功能上，GNPs-pIL-4通过双光子活体成像、激光散斑成像和超声光声成像证实，显著增加缺血肌肉中灌注血管数量、氧饱和度，并促进血管成熟（α-SMA阳性）。组织学分析显示，GNPs-pIL-4增加中央核肌纤维比例、减少肌纤维数量、增大平均横截面积，改善肌肉抗疲劳能力和最小收缩力保留。巨噬细胞耗竭实验（氯膦酸盐脂质体）证实，这些促再生促灌注效应依赖于巨噬细胞。机制上，单细胞RNA测序和CellChat分析发现，GNPs-pIL-4处理增强巨噬细胞与内皮细胞间的通讯，其中OSM信号通路被特异性激活。GNPs-pIL-4诱导巨噬细胞分泌OSM，后者通过下调内皮细胞GSNOR表达，增加内皮糖蛋白（ENG）C209位点的S-亚硝基化，从而促进内皮出芽、迁移和管状形成。OSM敲低（AAV-shOSM）或GSNOR敲除验证了该轴的关键作用。此外，在人类PAD转录组数据（GSE120642）中，GSNOR表达随疾病进展（从健康到间歇性跛行IC到慢性肢体缺血CLI）逐渐下降。该研究为PAD提供了免疫靶向纳米药物的新机制和治疗策略，论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**主要关键技术方法**
1. 三维石墨烯纳米颗粒（GNPs）的合成与表面修饰（叶酸FA和聚乙烯亚胺PEI偶联，用于巨噬细胞靶向和核酸负载）。
2. 小鼠后肢缺血（HLI）模型建立：通过股动脉结扎并切除，C57BL/6J小鼠（7周龄，雄性）用于实验。
3. 体内成像：激光散斑成像（灌注）、双光子活体成像（FITC-右旋糖酐标记灌注血管）、超声光声成像（氧饱和度）。
4. 单细胞RNA测序（10x Genomics平台）及CellChat细胞间通讯分析。
5. 蛋白S-亚硝基化检测：iodoTMT-switch assay结合Western blot。
6. 基因干预：氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞、AAV-shOSM敲低OSM、GSNOR敲除小鼠、siRNA敲低ENG及C209A突变体拯救实验。
（样本队列来源：人类PAD患者转录组数据集GSE120642，包含健康成人、间歇性跛行IC和慢性肢体缺血CLI患者。）

**研究结果**
- **Physicochemical characterization, nucleic acid loading capacity, and biological effects of GNPs in vitro and in vivo**：通过扫描电镜、动态光散射、MST、凝胶阻滞等表征，GNPs呈均匀球形、带正电荷，与质粒DNA结合力强（K_d ~25 nM），血清稳定性好，酸性条件下释放DNA。细胞摄取实验显示GNPs优先被RAW264.7巨噬细胞摄取，而非内皮细胞或成纤维细胞。体内，GNPs在肌肉中主要被F4/80⁺巨噬细胞摄取，且比脂质纳米颗粒（LNP）更高效递送报告质粒，无明显细胞毒性，生物分布集中在注射部位。
- **GNPs-pIL-4 promotes M2 macrophage polarization**：在HLI小鼠中，GNPs-pIL-4增加IL-4蛋白表达，下调M1标志物（Cd80、Nos2），上调M2a标志物（Arg1、Mrc1），不改变M2b/c标志物；多重细胞因子检测显示M2相关IL-4、IL-10升高，M1相关TNF-α、CCL3降低；单细胞测序证实Mrc1上调、CD86下调；体外实验显示GNPs-phIL-4促进人PBMC来源巨噬细胞向CD206⁺/CD80^? M2表型极化。
- **GNPs-pIL-4 promotes perfusion recovery and tissue regeneration in murine ischemic hindlimb**：双光子成像显示GNPs-pIL-4增加灌注血管数量；超声光声成像显示氧饱和度显著提高；CD31和α-SMA染色显示毛细血管密度增加且血管成熟；激光散斑成像示血流灌注改善；H&E和WGA染色示中央核肌纤维比例增加、肌纤维横截面积增大、肌纤维数量减少，提示再生和成熟；肌张力记录示抗疲劳能力和最小收缩力保留提升。长期观察至14天，GNPs-pIL-4效果优于LNP-pIL-4。
- **Macrophages mediate the GNPs-pIL-4–induced murine muscle regeneration and reperfusion after ischemia**：氯膦酸盐脂质体耗竭巨噬细胞后，GNPs-pIL-4改善肌肉功能、促进再生、增加灌注和氧饱和度的效应显著减弱，证实巨噬细胞是必需中介。
- **GNPs-pIL-4 activates macrophage secretory OSM signaling to further promote endothelial cell sprouting, migration, and tube formation**：单细胞RNA-seq GSEA分析显示内皮细胞中出芽血管生成通路富集；CellChat分析显示巨噬细胞-内皮细胞通讯增强，OSM信号独特激活。OSM在巨噬细胞中高表达。重组OSM促进股动脉环出芽、内皮细胞迁移和管状形成；GNPs-pIL-4处理巨噬细胞的条件培养基（MφCM）促内皮功能，被抗OSM中和抗体削弱。qPCR显示促血管生成基因（Kdr, Fgf1, Pdgfb, Angpt1）上调且被抗OSM抗体抑制。
- **OSM knockdown alleviates GNPs-pIL-4–induced muscle regeneration and angiogenesis in ischemic tissues of mice**：AAV-shOSM敲低OSM后，GNPs-pIL-4改善肌肉功能、灌注、氧饱和度、血管密度和促血管生成基因表达的效果显著减弱，证实OSM是体内关键介质。
- **GNPs-pIL-4 promotes perfusion and muscle recovery by down-regulating GSNOR protein expression in ischemic tissues**：单细胞RNA-seq显示“蛋白亚硝基化”通路富集，Adh5（编码GSNOR）下调。在人类PAD数据中GSNOR表达随疾病进展下降。巨噬细胞条件培养基（GNPs-pIL-4-MφCM）降低内皮细胞GSNOR蛋白，被抗OSM抗体逆转。重组OSM直接降低Adh5 mRNA及蛋白。RNA-seq示OSM激活JAK-STAT通路，预测STAT3结合Adh5启动子。GSNOR敲除小鼠（Gsnor^?/?）在HLI后出芽血管生成增加、灌注和氧饱和度改善、肌肉功能增强。
- **Endothelial GSNOR deficiency enhances S-nitrosylation of ENG and promotes sprouting angiogenesis**：iodoTMT-switch实验示GSNOR敲除或GNPs-pIL-4处理增加总蛋白S-亚硝基化。经MφCM或重组OSM处理，内皮细胞中ENG（而非CDC42）的S-亚硝基化水平升高。ENG C209位点保守，C209A突变体拯救实验显示，野生型ENG恢复OSM促迁移和管状形成作用，而C209A突变体失败。股动脉环出芽实验显示，AAV-shENG敲低ENG后，GNPs-pIL-4-MφCM的促出芽效应减弱。
- **GNPs-pIL-4 reprograms macrophage polarization and activates the OSM/GSNOR/ENG axis to improve angiogenesis and tissue repair in ischemic limbs**：总结图显示，在HLI中，M1巨噬细胞导致炎症和血管生成受损；GNPs-pIL-4通过递送IL-4驱动M2a极化，增强OSM分泌；OSM下调内皮GSNOR，增加ENG S-亚硝基化，从而促进血管生成、灌注恢复、肌肉再生和组织修复。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，PAD的高发病率和不良预后凸显了开发新治疗策略的紧迫性。本研究开发的GNPs-pIL-4系统通过重编程巨噬细胞极化、激活OSM/GSNOR/ENG轴，实现了有效的治疗性血管生成和肌肉功能恢复，且具有良好的生物相容性。与单一生长因子（如VEGF、FGF）治疗相比，微环境调节策略更具生物学合理性。OSM介导的巨噬细胞-内皮通讯是核心机制，但OSM的作用具有病理情境依赖性（如在视网膜病变中抑制血管新生）。GSNOR在应激性血管重塑中扮演关键负调控角色，其敲除促进缺血后血管生成，而不影响正常灌注。ENG的C209位点S-亚硝基化是此前未报道的调控机制。研究存在的局限性包括：急性HLI模型不能完全模拟慢性PAD；小鼠侧支循环丰富；未纳入糖尿病、高脂血症等合并症。未来需在更复杂的慢性缺血模型中验证。
**研究结论部分翻译**：总之，本研究提出了一种基于GNPs的IL-4基因递送平台，该平台能够调节巨噬细胞极化、重塑缺血微环境，并显著改善后肢缺血。此外，研究人员确定了OSM-GSNOR-ENG轴是该过程中促进血管生成和组织恢复的核心机制，为PAD治疗提供了新的机制见解、治疗靶点和转化潜力。