成纤维细胞通过响应白细胞介素-1并招募中性粒细胞来抵抗皮肤表面的金黄色葡萄球菌

《SCIENCE ADVANCES》：Fibroblasts resist Staphylococcus aureus on the skin surface by responding to interleukin-1 and recruiting neutrophils

　　

摘要：金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）可引起严重感染，但也可在皮肤表面定居而不致病。这一看似矛盾的现象暗示了强大的宿主防御系统，阻止了金黄色葡萄球菌侵入真皮。在本研究中，研究人员探究了皮肤如何检测并响应浅表的金黄色葡萄球菌暴露。通过使用无偏转录组学、生物化学和磷酸化蛋白质组学分析，随后在人类和小鼠模型中进行靶向验证，研究人员发现，成纤维细胞对白细胞介素-1（IL-1）的识别对于免疫应答至关重要。在体外，成纤维细胞中白细胞介素-1受体1型（IL-1R1）的缺失或阻断消除了由角质形成细胞驱动的基因表达变化，并减少了趋化因子的产生。此外，在局部应用金黄色葡萄球菌后，缺乏成纤维细胞IL-1R1的小鼠皮肤中中性粒细胞数量减少，细菌载量更高。这些发现表明，成纤维细胞积极参与先天免疫，并突出了一个依赖于IL-1R1的角质形成细胞-成纤维细胞-中性粒细胞通讯轴。理解这一通路为阐明启动中性粒细胞向皮肤募集的机制提供了见解，并可能有助于开发新的治疗方法。

**论文解读：成纤维细胞在皮肤抗金黄色葡萄球菌免疫中的关键作用：IL-1R1依赖性通讯轴**

**研究背景**

金黄色葡萄球菌（*Staphylococcus aureus*）是一种重要的人类病原体，全球约30%的人群被其定殖。尽管其具有强大的毒力因子，但在健康宿主中，完整的皮肤屏障通常能有效限制其侵入性感染。这一现象暗示皮肤存在快速且强大的防御机制，能够抑制浅表微生物的早期生长。然而，目前对皮肤如何将浅表微生物的检测信号转化为深层组织的免疫激活，并协调中性粒细胞（消灭金黄色葡萄球菌最关键的细胞）的招募，这一过程中的细胞通讯机制尚不完全清楚。尽管已知角质形成细胞、真皮巨噬细胞等细胞类型参与免疫应答，且白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF）等多种细胞因子能放大炎症，但早期交叉通讯的细胞架构仍未被深入理解。近年来的研究扩展了非经典免疫细胞在皮肤免疫中作用的认识，真皮成纤维细胞（FBs）因其在炎症性疾病中呈现免疫活化状态并产生趋化因子，被视为能够塑造局部免疫的潜在参与者，但其在控制皮肤表面金黄色葡萄球菌中的作用尚属未知。

**研究内容与结论**

为填补这一知识空白，研究人员结合了无偏转录组学、磷酸化蛋白质组学、靶向体外实验及体内感染模型，系统定义了皮肤早期检测金黄色葡萄球菌后如何协调深层组织的中性粒细胞招募。研究揭示了一个关键的角质形成细胞-成纤维细胞-中性粒细胞通讯轴，其核心机制是：在皮肤表面，增殖的金黄色葡萄球菌触发角质形成细胞释放白细胞介素-1α（IL-1α）。这种信号分子穿透基底膜，被真皮成纤维细胞上的白细胞介素-1受体1型（IL-1R1）识别。激活的成纤维细胞迅速转变为免疫活化状态，表现为免疫活化成纤维细胞（IAF）表型，并大量产生以中性粒细胞趋化因子CXCL1、CXCL2及粒细胞集落刺激因子CSF3为主的趋化因子和炎症介质，从而有效招募中性粒细胞至感染部位，执行抗菌防御。研究证实，无论是通过抗体中和IL-1α，还是在成纤维细胞中特异性敲除IL-1R1，均会导致中性粒细胞招募受损、细菌载量增加以及更严重的皮肤病变。该研究确立了成纤维细胞在皮肤先天免疫前线中的核心地位，并定义了IL-1R1依赖性角质形成细胞-成纤维细胞-中性粒细胞通讯轴在抵抗金黄色葡萄球菌浅表感染中的关键作用。该论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。

**关键技术方法**
1. **单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析**：对局部应用金黄色葡萄球菌或溶剂的小鼠皮肤进行scRNA-seq，鉴定细胞类型，并通过CellChat进行细胞间通讯网络分析，以及通过伪批量差异表达分析和免疫活化成纤维细胞（IAF）评分来表征成纤维细胞亚群的转录组特征。
2. **体外条件培养基实验**：建立角质形成细胞条件培养基（KC-CM）刺激人成纤维细胞系（HPAd）或原代小鼠真皮成纤维细胞的模型，通过RNA测序、qPCR和多重免疫分析检测成纤维细胞中趋化因子和细胞因子的表达变化。
3. **磷酸化蛋白质组学分析**：对KC-CM刺激后的成纤维细胞进行磷酸化蛋白质组学分析，以鉴定参与免疫激活的早期信号通路，并结合生化特性分析（如热敏性、蛋白酶K敏感性、分子大小分馏）来鉴定KC-CM中的关键活性因子。
4. **体内基因敲除小鼠模型：**利用Pdgfra^Cre驱动在成纤维细胞谱系中特异性敲除IL-1R1的Pdgfra^ΔIl1r1小鼠，结合局部金黄色葡萄球菌感染模型，通过免疫组化（IHC）、qPCR及细菌负荷定量等方法，在体内验证成纤维细胞IL-1R1信号在宿主防御中的关键作用。样本来源包括C57BL/6背景的小鼠。

**研究结果**

**Fibroblasts are a major immune signaling hub in topical S. aureus response**
通过分析已发表的局部金黄色葡萄球菌感染小鼠皮肤scRNA-seq数据集，发现真皮成纤维细胞（FBs）是与髓系细胞通讯的主要细胞类型，而非此前认为的表皮角质形成细胞。金黄色葡萄球菌处理后的皮肤中，FBs显示出强烈的炎症转录特征，包括趋化因子（Cxcl1, Cxcl2）和粒细胞生长因子（Csf3）等基因上调。通过层级聚类，鉴定出14个不同的FB亚群，其中部分亚群在感染后富集，并表现出高免疫活化成纤维细胞（IAF）评分，表明FBs经历了全局性的转录重编程。

**Keratinocytes activate FBs to recruit neutrophils**
通过设计条件培养基（KC-CM）实验，研究人员发现，金黄色葡萄球菌刺激的角质形成细胞释放的信号能强力激活人成纤维细胞，诱导其表达包括CXCL1、CXCL8、CSF3和CCL2在内的趋化因子和炎症介质基因。RNA-seq证实了这些基因的诱导，并富集于炎症信号通路。功能实验表明，被KC-CM活化的成纤维细胞的条件培养基（FB-CM）能够显著促进中性粒细胞（主要招募的细胞类型）以及其他白细胞（如经典单核细胞）的跨膜迁移，证明了其功能性趋化活性。

**IL-1α is a candidate keratinocyte activator of FBs**
磷酸化蛋白质组学分析显示，KC-CM刺激的FBs中，与AP-1、JNK等信号通路相关的蛋白发生磷酸化变化。生物化学特性分析表明，KC-CM中的活性因子是一种热敏感、蛋白酶K敏感、大小为10-50 kDa的蛋白质。通过筛选候选重组蛋白，发现IL-1α能最有效地复现KC-CM对FBs的激活效应。scRNA-seq数据显示，IL-1受体（Il1r1）在FBs中高表达，尤其在IAF评分高的亚群中。同时，角质形成细胞是皮肤中IL-1α的主要来源，且金黄色葡萄球菌能诱导其释放。

**Keratinocytes trigger FB immune activity through IL-1α–IL-1R1 signaling**
利用基因敲除和药理学阻断实验，研究人员证实了IL-1α-IL-1R1信号通路的必要性。来自Il1r1^-/-小鼠的原代真皮FBs对KC-CM的刺激无反应。在人成纤维细胞中，IL-1R1拮抗剂阿那白滞素（anakinra）或IL-1α中和抗体能有效阻断KC-CM诱导的趋化因子表达，而IL-1β抗体则无效。RNA-seq分析进一步证实，阻断IL-1R1几乎完全抑制了IAF基因程序。

**Topical S. aureus triggers epidermal release of immunity-required IL-1α**
在体内，局部金黄色葡萄球菌感染后，表皮中的IL-1α在14小时内显著增加并延伸至真皮，与趋化因子诱导和中性粒细胞招募的时间点一致。系统性地中和IL-1α会损害中性粒细胞招募，并在48小时后导致皮肤病变更严重，细菌载量更高。

**Fibroblast IL-1R1 signaling drives early immune activation in vivo**
利用Pdgfra^ΔIl1r1小鼠（成纤维细胞特异性IL-1R1敲除），研究人员在体内验证了FB IL-1R1的关键作用。scRNA-seq分析显示，Pdgfra^ΔIl1r1小鼠皮肤中的FBs在金黄色葡萄球菌感染后，其IAF程序被显著抑制，趋化因子（如Cxcl1, Ccl2）表达下降。qPCR结果也证实了这一点。

**Loss of FB IL-1R1 signaling alters myeloid cell programming**
FB IL-1R1信号的缺失不仅影响FB自身，还改变了髓系细胞的转录程序。在Pdgfra^ΔIl1r1小鼠的髓系细胞中，与中性粒细胞靶向趋化因子相关的通路受到抑制，而与干扰素相关的趋化因子表达上调，表明FB IL-1R1信号有助于塑造皮肤微环境中的髓系细胞群。

**Fibroblast IL-1R1 signaling is critical to neutrophil recruitment and antimicrobial defense**
免疫组化染色显示，在Pdgfra^ΔIl1r1小鼠中，感染后14小时皮肤上真皮中的中性粒细胞标志物Ly6G和关键抗菌肽Cathelicidin（CAMP）的丰度均显著降低，说明FB IL-1R1信号对于中性粒细胞招募和局部抗菌防御至关重要。

**Fibroblast IL-1R1 signaling protects against invasion by S. aureus**
在感染48小时后，Pdgfra^ΔIl1r1小鼠表现出更严重的皮肤病变（更大的病灶面积、更红的红斑、更高的严重程度评分），表皮增厚和组织浸润减少，金黄色葡萄球菌侵入表皮（尤其是毛囊）的程度增加，且皮肤表面活菌数量更高，表明FB IL-1R1信号是抵抗金黄色葡萄球菌侵入性感染的关键。

**讨论与结论**

本研究发现并定义了一个此前未被充分认识的皮肤免疫通讯轴，即角质形成细胞-成纤维细胞-中性粒细胞轴。在健康皮肤面对浅表金黄色葡萄球菌威胁时，角质形成细胞作为第一道防线，迅速释放IL-1α。该信号被真皮成纤维细胞上的IL-1R1识别，促使成纤维细胞转变为免疫活化状态（IAF），并产生大量趋化因子，从而有效招募中性粒细胞。这一机制将浅表微生物的检测与深层真皮反应联系起来，解释了为何在屏障完整的健康宿主中，金黄色葡萄球菌感染很少进展为侵入性感染。研究人员总结认为，真皮成纤维细胞不仅是结构细胞，更是先天免疫前线的关键玩家，它们通过感知IL-1信号来协调中性粒细胞驱动的抗菌防御，并可能通过未知机制影响角质形成细胞的抗菌肽产生。该研究为理解皮肤如何启动针对金黄色葡萄球菌的免疫反应提供了重要机制，并可能为开发新的治疗策略，以预防金黄色葡萄球菌从良性定殖者转变为侵入性威胁，提供了潜在靶点。