模拟PD-L1细胞内结构的多聚二甲双胍可协同增强巨噬细胞对结直肠癌的抗原呈递，从而用于口服免疫疗法

《Biomaterials》：PD-L1 intracellular domain-mimicked poly-metformin synergistically enhances macrophage antigen presentation for colorectal cancer oral immunotherapy

　　

摘要

微卫星稳定的结直肠癌是最常见的结直肠癌亚型，由于其较低的突变负荷以及具有免疫抑制作用的肿瘤微环境，这类癌症对以T细胞为靶点的免疫检查点阻断疗法具有抗性。尽管将肿瘤相关巨噬细胞重编程为具有杀伤能力的M1样状态是一种有前景的替代方案，但其效果受到M1样巨噬细胞上程序性细胞死亡配体1表达上调以及它们本身较差的抗原呈递能力的限制。在此，我们发现聚甲福明能够模拟PD-L1的细胞内结构域，竞争性抑制PD-L1在膜上的定位，从而有效降低细胞表面的PD-L1水平。为评估聚甲福明在免疫抑制型的微卫星稳定结直肠癌中的治疗效果，我们进一步开发了一种口服益生菌外膜囊泡基因递送系统——siYthdf2/PMet@Akk-OMV，并证明了该系统能够降低巨噬细胞和肿瘤细胞上的PD-L1水平，同时增强巨噬细胞对肿瘤抗原的呈递能力，进而激活特定的抗肿瘤免疫反应，显著抑制肿瘤生长。这项研究为治疗那些对传统免疫检查点阻断疗法具有抗性的癌症提供了理论和实验基础。

引言

以适应性免疫细胞为靶点的免疫治疗策略，如程序性细胞死亡-1受体/程序性细胞死亡配体1免疫检查点阻断疗法，已展现出出色的临床疗效。然而，对于占所有结直肠癌病例约85%比例的微卫星稳定型结直肠癌而言，这种阻断疗法的效果仍然有限，其主要原因在于肿瘤突变负荷较低以及淋巴细胞浸润不足[1]、[2]。实际上，先天免疫细胞与适应性免疫细胞之间的有效协作对于免疫治疗的成功至关重要[3]。除了浸润的T细胞之外，利用肿瘤微环境中大量存在的巨噬细胞来恢复免疫监视功能，也被视为治疗微卫星稳定型结直肠癌的一种有效方法[4]。不过，在免疫抑制性的肿瘤微环境作用下，巨噬细胞大多会呈现促肿瘤的M2样极化状态，即肿瘤相关巨噬细胞[5]。与此同时，结直肠癌细胞会促使肿瘤相关巨噬细胞过度表达程序性细胞死亡配体1，这会限制巨噬细胞向T细胞呈递肿瘤抗原，进而抑制T细胞的活性[6]、[7]。

通常，通过调控肿瘤相关巨噬细胞向M1样表型转变的重新编程疗法，可以利用M1样巨噬细胞的直接杀伤能力[8]。然而，这些M1样巨噬细胞反而会进一步上调PD-L1的表达，限制抗原向T细胞的呈递[9]、[10]。此外，与树突状细胞相比，巨噬细胞处理外源抗原并将其呈递给CD8⁺ T淋巴细胞的能力较为有限，这也削弱了它们激活细胞毒性T淋巴细胞的能力[11]、[12]。因此，要想实现以巨噬细胞为中心的免疫治疗策略，就必须同时降低细胞表面的PD-L1水平并提升巨噬细胞的抗原呈递能力。

先前的研究表明，PD-L1的细胞内结构域可能在维持PD-L1稳定性以及介导细胞内信号传导方面起着关键作用[13]。在该结构域中，PD-L1-ICD_260-265呈现出α螺旋状的阳离子结构，PD-L1中的三个关键精氨酸残基与内膜中的酸性磷脂之间的相互作用，对于PD-L1在膜上的定位至关重要（见图1a）[14]。若用其他阳离子氨基酸替换这些残基，将会显著降低PD-L1在膜上的定位能力[15]。此外，PD-L1-ICD_270-281区域中大量的赖氨酸残基也有助于PD-L1在膜上的定位，而且这些赖氨酸残基与PD-L1的泛素化及降解过程密切相关[16]、[17]。因此，为了模拟PD-L1-ICD_260-281中富含碱性氨基酸的肽段，我们提出并证实，聚甲福明这种具有生物稳定性的阳离子聚合物——其碳骨架具有灵活性，侧链则含有胍基——能够有效降低巨噬细胞和肿瘤细胞上的PD-L1水平。

此外，聚甲福明所含的聚阳离子胍基这一结构特性，有助于高效地负载和递送核酸药物。为提升巨噬细胞通过主要组织相容性复合体I类分子呈递外源肿瘤抗原的效率，我们选择了靶向Ythdf2的小干扰RNA作为递送载体，该RNA能够介导巨噬细胞的表观遗传重编程，与聚甲福明带来的PD-L1降低效应协同作用，进而增强巨噬细胞引发的适应性免疫反应[18]、[19]。为提高患者的用药依从性，我们将siYthdf2/PMet复合物封装在来自益生菌Akkermansia muciniphila的外膜囊泡中，从而构建了一种稳定的口服益生菌外膜囊泡基因递送系统——siYthdf2/PMet@Akk-OMV，该系统具有耐胃酸性、能定向作用于肿瘤以及具备使巨噬细胞向M1样状态极化的能力（见图1b和c）。值得注意的是，siY/PM@A还具有修复肠道屏障和调节肠道菌群的功能，这些作用有助于为抗肿瘤免疫反应的激活创造有利的环境。我们已经验证，这种经过设计的siY/PM@A能够为强大的、特异性的抗肿瘤免疫反应提供良好的免疫环境，在原位结直肠癌小鼠模型中，无论是单独使用还是与一线化疗药物奥沙利铂联合使用，都具有显著的抗肿瘤效果。这项研究为解决微卫星稳定型结直肠癌中的免疫学障碍提供了理论依据和可行的治疗策略，也为未来免疫疗法的组合设计提供了参考。

章节节选

材料

线性聚乙二烯亚胺（PEI，分子量约为2,730、5,200或15,000）和二氰胺（DCD）购自Sigma-Aldrich公司。盐酸则从广州化学试剂厂购买。巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、白介素-4（IL-4）以及PD-1则从MedChemExpress公司采购。脂多糖（LPS）和5(6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）则购自Invitrogen公司。甲福明和奥沙利铂则由Aladdin Biochemical Technology公司提供。

聚甲福明的最佳分子量确定及分子动力学模拟

为判断聚甲福明是否具有预期的生物活性，并确定其用于生物医学应用的最佳分子量，我们首先通过不同分子量的PEI（分子量约为2,730、5,200或15,000）与DCD发生反应，合成了一系列聚甲福明聚合物（见图S1a）。随后，我们检测了不同分子量的聚甲福明降低BMDM细胞中膜上PD-L1水平的功效，实验对象包括未经处理的M2样巨噬细胞、未经处理的M1样巨噬细胞，以及用甲福明处理过的M1样巨噬细胞。

结论

微卫星稳定型结直肠癌由于突变负荷低且淋巴细胞浸润受限，因此对单用免疫检查点抑制剂治疗往往反应不佳。这类癌症占所有结直肠癌病例的约85%，通常被视为典型的“免疫冷肿瘤”。要克服微卫星稳定型结直肠癌对免疫治疗的抵抗性，需要采取双重策略：一方面提升肿瘤抗原的呈递效率，另一方面重新塑造具有免疫抑制作用的肿瘤微环境，为T细胞发挥作用创造条件。

CRediT作者贡献说明

吴美英：撰写——审阅与编辑、指导、项目管理、资金获取、概念构思。于绵：撰写——审阅与编辑、指导、项目管理、资金获取、概念构思。王天琪：撰写——审阅与编辑、指导、项目管理、资金获取、概念构思。李勇：方法学研究。文思敏：方法学研究。周阳：资源准备、实验开展。余嘉茵：方法学研究、实验开展。郝慧松：数据可视化、资源协调。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

数据可用性

数据将在有需求时提供。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

作者衷心感谢中国国家自然科学基金委员会（项目编号为32322043、32571539和82502567）、预防控制重大新发传染病——“国家科技重大专项”（项目编号为2026ZD01913001）、中国博士后科学基金会博士后科研资助计划（项目编号为GZB20250840），以及深圳市科学技术创新委员会和深港澳科技创新计划C项（项目编号为SGCX20250526141303005）对本研究的资助。部分插图也得到了相关机构的支持。

孙胜杰|方一轩|郝慧松|余嘉茵|周阳|文思敏|李勇|王天琪|于绵|吴美英

中国广东省深圳市中山大学药学院，邮编518107