在少孢根霉（Rhizopus oligosporus）固态发酵过程中刺五加（Eleutherococcus senticosus）叶中植物化学物质和功能特性的转化

《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》：Transformation of phytochemicals and functional properties in Eleutherococcus senticosus leaves during solid-state fermentation with Rhizopus oligosporus

　　

将刺五加（Eleutherococcus senticosus, E. senticosus）叶与少孢根霉（Rhizopus oligosporus, R. oligosporus）KCCM11948P进行固态发酵（solid-state fermentation, SSF）120小时，以评估植物化学物质和功能特性的变化。发酵提高了水膨胀性（water-swelling）、持水性（water-holding）、胆固醇结合能力（cholesterol-binding）和吸油能力（oil absorption）。绿原酸（chlorogenic acid）在发酵72小时后下降了33.7%，而咖啡酸（caffeic acid）增加了33.5%。L-肉碱（L-carnitine）在72小时首次被检测到，并在120小时后达到15.67±0.50 mg/kg干重（dry mass, DM），而β-谷甾醇（β-sitosterol）增加了105.2%。总酚（total phenolic）和总黄酮（total flavonoid）含量分别增加了38.6%和20.8%。通过FRAP（ferric reducing antioxidant power）、ABTS（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）和ORAC（oxygen radical absorbance capacity）法测定的抗氧化活性在整个发酵过程中均有所增加，并且在RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（nitric oxide, NO）抑制活性比非发酵叶提高了83.0%。这些结果表明，使用少孢根霉（R. oligosporus）进行固态发酵改善了刺五加（E. senticosus）叶的植物化学组成和功能特性，支持其作为功能性成分的潜在用途。

**研究背景与目的**
刺五加（Eleutherococcus senticosus, E. senticosus）是一种广泛分布于亚洲的药用可食用植物，其叶富含酚类、黄酮类、三萜皂苷和多糖等生物活性化合物，具有抗氧化、抗阿尔茨海默病、抗糖尿病和抗肥胖等潜在健康益处。然而，与根、茎皮等传统药用部位相比，刺五加叶作为可再生且可持续的生物质资源，目前利用不足。固态发酵（solid-state fermentation, SSF）是一种低能耗、高效率的微生物处理技术，可利用真菌（如少孢根霉Rhizopus oligosporus）产生的酶系改变植物基质，释放或生成新的生物活性化合物。现有研究多集中于刺五加生物活性成分的鉴定及其生物学效应，缺乏同时分析微生物生长、酶活性与生物活性化合物动态变化的综合性研究。因此，本研究旨在评估少孢根霉（R. oligosporus）KCCM11948P固态发酵对刺五加叶物理功能特性、植物化学组成、抗氧化活性及抗炎潜力的影响，为其作为功能性食品原料的开发提供依据。论文发表在《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》。

**主要技术方法**
研究人员采用固态发酵（SSF）方法，将刺五加叶（来源：韩国平昌当地农场）与少孢根霉（R. oligosporus）KCCM11948P在30°C、60%相对湿度条件下发酵120小时，每隔24小时取样。通过水提取获得冻干粉末样品。物理特性测定包括持水性（water holding capacity, WHC）、水膨胀性（water swelling capacity, WSC）、吸油能力（oil absorption capacity, OAC）和胆固醇结合能力（cholesterol binding capacity, CBC）。植物化学分析采用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）测定绿原酸、咖啡酸、奎宁酸和L-肉碱，薄层色谱（TLC）测定β-谷甾醇，Folin-Ciocalteu法测定总酚含量（total phenolic content, TPC），氯化铝比色法测定总黄酮含量（total flavonoid content, TFC）。抗氧化活性通过ABTS（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)）自由基清除、FRAP（ferric reducing antioxidant power）、ORAC（oxygen radical absorbance capacity）和总抗氧化能力（total antioxidant capacity, TAC）四种方法评估。抗炎活性通过检测脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）刺激的RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（nitric oxide, NO）的抑制率来评价。

**研究结果**
**固态发酵对物理特性的影响**
- **持水性（WHC）、水膨胀性（WSC）和吸油能力（OAC）**：发酵96小时后，WHC从4.15 g/g增至5.47 g/g（增加31.8%）；WSC在120小时后从2.70 mL/g增至6.16 mL/g（增加128.1%）；OAC在120小时后从4.59 g/g增至5.61 g/g（增加22.2%）。增加归因于真菌酶解导致叶片微观结构疏松，暴露亲水基团并物理截留油脂。
- **胆固醇结合能力（CBC）**：在pH 2.0（模拟胃环境）下，发酵120小时后CBC增加230.7%；在pH 7.0（模拟小肠环境）下，发酵72小时后CBC增加318.2%，之后趋于稳定。CBC的提高可能与三萜皂苷含量变化有关。

**固态发酵对生化特性的影响**
- **麦角甾醇（ergosterol）含量**：作为真菌生长标志物，麦角甾醇在发酵24小时后被检出，96小时达到最大值107.92 mg/kg DM，随后下降，表明真菌生长在96小时达到峰值。
- **L-肉碱（L-carnitine）含量**：发酵72小时首次检出L-肉碱（5.34 mg/kg DM），120小时升至15.67 mg/kg DM。该合成依赖于真菌胞外蛋白酶释放的赖氨酸和甲硫氨酸前体，通过保守的四步途径（包括ε-N-三甲基赖氨酸中间体）实现。
- **绿原酸、咖啡酸和奎宁酸含量**：绿原酸从0小时的7894.08 mg/kg DM持续下降至120小时的5233.53 mg/kg DM（降低33.7%）；咖啡酸在72小时达到峰值（增加33.5%），之后下降；奎宁酸先降后升，120小时较非发酵叶增加4.3%。这些变化归因于真菌酯酶水解绿原酸释放咖啡酸和奎宁酸，以及后续微生物代谢消耗。
- **β-谷甾醇（β-sitosterol）含量**：β-谷甾醇在发酵120小时后增加205.2%（从初始值升至5503.91 mg/kg DM）。其水溶性增加可能得益于皂苷的胶束化作用，以及真菌酶解细胞壁释放结合态甾醇。
- **总酚（TPC）和总黄酮（TFC）含量**：TPC在72小时达到峰值（28.00 mg GAE/g DM，增加38.6%），之后下降；TFC在24小时达到峰值（增加20.8%），之后下降。初期增加源于真菌水解酶释放结合态酚类，后期下降则因酚类被用作碳源或发生氧化聚合。

**抗氧化特性**
通过ABTS（SC₅₀值）、FRAP、ORAC和TAC四种方法评价，抗氧化活性在72小时达到峰值：ABTS的SC₅₀降低22.7%，FRAP、TAA和ORAC分别增加10.2%、30.4%和8.8%。之后随发酵时间延长，抗氧化活性下降，与TPC、TFC、绿原酸和咖啡酸含量的降低趋势一致。抗氧化活性增强与咖啡酸、β-谷甾醇、TPC、TFC的升高以及L-肉碱的新合成密切相关。

**细胞活力与一氧化氮抑制活性**
在RAW264.7巨噬细胞中，所有测试浓度（400和800 μg/mL）均未观察到细胞毒性。在800 μg/mL下，发酵72小时的NO抑制活性较非发酵叶提高40.9%；在400 μg/mL下，发酵96小时的NO抑制活性提高83.2%。这表明发酵增强了刺五加叶的抗炎潜力。

**相关性分析**
Pearson相关分析显示：抗氧化活性（FRAP、ORAC、TAA）与TPC、绿原酸、咖啡酸呈正相关；物理特性（WSC、OAC、CBC）及NO抑制活性与麦角甾醇、L-肉碱、β-谷甾醇呈强正相关。主成分分析（PCA）表明，PC1和PC2累计解释92.28%的方差，样本按发酵时间呈现明显分离，后期样品与L-肉碱、β-谷甾醇及NO抑制活性正相关，说明真菌代谢重塑了叶片的化学和功能特征。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，固态发酵过程中真菌酶系（如酯酶、纤维素酶、蛋白酶等）的协同作用驱动了植物化学物质的转化与积累，最终优化了物理功能和生物活性。研究结论翻译如下：总之，利用少孢根霉（R. oligosporus）对刺五加（E. senticosus）叶进行固态发酵（SSF）改善了其理化性质并增强了功能潜力。该生物过程促进了重要生物活性化合物的积累，包括L-肉碱（15.67 mg/kg DM）、麦角甾醇（107.92 mg/kg DM）、咖啡酸（4356.84 mg/kg DM）和β-谷甾醇（5503.91 mg/kg DM），同时提高了抗氧化活性（8.8–30.4%）并抑制了LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（NO）的产生。综合来看，这些发现表明，少孢根霉介导的发酵通过增强功能特性有效利用了未充分利用的刺五加叶生物质，从而支持其作为功能性食品成分的潜在应用。未来展望方面，需要开展中试规模研究以验证优化后72小时SSF工艺的生产效率、成本效益和工艺一致性。尽管少孢根霉被普遍认为是安全的（GRAS），但在商业应用前仍需对发酵刺五加叶产品进行全面的毒理学评估。基于当前结果，72小时发酵在增强抗氧化活性和抗炎功效之间提供了最佳平衡，使其成为功能性刺五加成分工业生产的可行加工条件。