Activity-Dependent Increases in Quantal Size at the Drosophila NMJ

《Journal of Developmental Biology》：Activity-Dependent Increases in Quantal Size at the Drosophila NMJ

　　

研究人员探究了突触活动增加是否导致果蝇（Drosophila）三龄幼虫神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）处量子大小（quantal size）的增加。在神经刺激前后，研究人员记录了自发微型兴奋性突触后电流（miniature excitatory postsynaptic currents, mEPSCs）或自发微型兴奋性突触后电位（miniature excitatory postsynaptic potentials, mEPSPs）。研究人员发现，长时间（60秒）或短暂（1.25秒）的神经刺激均引起量子大小增加；这似乎是这些突触的普遍特性，因为在本研究使用的所有四种肌纤维（muscle fibers, MFs）中均观察到该现象。通过在肌纤维膜中表达GCaMP并检测自发递质释放产生的突触后Ca²⁺信号，研究人员沿Is和Ib终末对该效应进行了分析。活动依赖性量子大小增加在Is和Ib终末均发生，且单个突触扣结处量子事件频率和幅度的增加具有相关性。基于对肌纤维预注射Ca²⁺螯合剂BAPTA（1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N′,N′-四乙酸）的研究，量子大小和频率的增加均依赖于突触后Ca²⁺的升高。为探究突触后活动对谷氨酸敏感性的影响，研究人员在NMJ处离子电渗施加谷氨酸脉冲，并记录谷氨酸诱发的兴奋性突触后电位（glutamate-evoked excitatory postsynaptic potentials, gEPSPs）。谷氨酸脉冲序列引起gEPSP幅度增加；当从浴液中去除Ca²⁺或抑制钙调蛋白（calmodulin）或CaMKII后，该增强现象消失。活动依赖性量子大小增加可能源于CaMKII激活导致的突触后敏感性升高。

**论文解读：果蝇神经肌肉接头处活动依赖性量子大小增加的研究**

**研究背景与问题**
突触在神经信号传递中起关键作用，突触强度的可塑性是神经环路功能的基础。长期以来，突触可塑性是研究热点，涉及快速且持久的效能变化。果蝇（Drosophila）幼虫神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）因突触可及且可识别，成为研究突触发育、可塑性及分子机制的重要模型。此前，在果蝇NMJ中探索的突触可塑性主题包括突触稳态和活动依赖性突触增强。突触稳态可塑性在动物生命周期中维持突触强度，而活动依赖性突触增强在突触发育、维持及成年脑可塑性中发挥关键作用。然而，在脊椎动物NMJ中，活动依赖性突触增强最初表现为递质释放增加，导致易化、增强和强直后增强。在哺乳动物中枢神经系统（CNS）的长时程增强（long-term potentiation, LTP）中，突触可塑性还涉及突触后膜对神经递质敏感性的增加，即量子大小（quantal size）的增加。但关于短暂刺激引起量子大小增加的现象，在NMJ中尚未报道，也未证明是突触的普遍特征。少数研究报道了NMJ中活动依赖性量子大小增加，但涉及长时间活动变化。因此，研究人员旨在探究果蝇幼虫NMJ中冲动活动对量子大小的影响，以及突触后Ca²⁺的作用。

**研究内容与结论**
研究人员通过电生理和光电生理技术，发现短暂高频刺激（如80 Hz、1.25秒）能引起量子大小增加，该效应持续约10分钟，且出现在所有检查的肌纤维（MFs 4、5、6、7）和两种运动终末（Is和Ib）上。进一步研究表明，该增强依赖于突触后Ca²⁺的升高：预注射Ca²⁺螯合剂BAPTA可阻断短暂刺激引起的量子大小和频率增加。通过离子电渗施加谷氨酸脉冲，研究人员模拟了递质释放，发现重复谷氨酸刺激能引起突触后谷氨酸敏感性升高，该效应依赖于Ca²⁺内流，且被钙调蛋白抑制剂TFP或CaMKII抑制剂KN-93阻断。因此，活动依赖性量子大小增加可能源于突触后CaMKII激活导致的谷氨酸敏感性升高。该研究首次在NMJ中描述短暂刺激引起的量子大小增加，并揭示其普遍性及突触后Ca²⁺-CaMKII通路的作用。论文发表在《Journal of Developmental Biology》。

**主要关键技术方法**
1. 电生理记录：使用锐利微电极（20–30 MΩ，填充3M KCl）记录自发性微型兴奋性突触后电位（mEPSPs）或电流（mEPSCs），通过Axoclamp 2A或GeneClamp 500放大器采集数据，采样率10 kHz。
2. Ca²⁺成像：将UAS-myrGCaMP6s雌蝇与Mef2-GAL4雄蝇杂交，使肌纤维膜表达GCaMP6s；利用CMOS相机以20 Hz帧率采集自发Ca²⁺信号，激发光为75 W氙灯经480 nm带通滤光片。
3. 谷氨酸离子电渗：电极填充0.5 M谷氨酸钠，通过15 ms电流脉冲施加谷氨酸，记录诱发的兴奋性突触后电位（gEPSPs）。
4. BAPTA注射：使用含0.5 M BAPTA四钾盐的电极，以800 ms、-30 nA的超极化脉冲（1 Hz）注入MF7，持续5或10分钟，以缓冲细胞内Ca²⁺。
5. 样本来源：所有实验使用Canton-S（CS）品系雌性果蝇三龄幼虫，饲养于25°C Jazz Medium（Fisher Scientific）。

**研究结果**
**3.1. 神经刺激引起mEPSC增强**
在HL3盐溶液中以20 Hz刺激神经1分钟，记录MF6和MF5的mEPSC。结果显示，刺激后mEPSC幅度、电荷转移量显著增加（MF6电荷转移增加64%，MF5增加78%），且增强持续约10分钟。

**3.2. 短暂高频刺激引起mEPSP增强**
在HL3或HL3.1盐溶液中，以不同频率和时长刺激神经（如80 Hz、1.25秒），记录MF6的mEPSP。刺激后mEPSP幅度显著增加（HL3中80 Hz、1.25秒增加24%；HL3.1中80 Hz、1.25秒增加25%），且增强程度与刺激频率和时长相关。

**3.3. mEPSP幅度受体内活动增强**
比较解剖后不同时间（5、20、30、45分钟）的mEPSP幅度，发现解剖后立即记录（5分钟）的mEPSP幅度显著大于休息20分钟后的值（降低24%），表明体内活动可增强量子大小。

**3.4. 量子Ca²⁺信号的增强**
在表达GCaMP的MF4上，以80 Hz、5秒刺激神经，通过成像检测自发Ca²⁺信号。刺激后，Is和Ib终末的Ca²⁺信号幅度均显著增加（Is增加53.4%，Ib增加31.5%），频率也增加（Is增加103.6%，Ib增加93.1%）。沿终末不同位置（远端与近端扣结）的增强幅度无显著差异，但单个扣结处频率与幅度增加呈正相关。

**3.5. 量子大小增强依赖于突触后Ca²⁺浓度升高**
在MF7中预注射BAPTA后，以20 Hz、1分钟刺激时，mEPSC幅度增加未被阻断，但频率增加；以80 Hz、1.25秒刺激时，BAPTA注射完全阻断了mEPSP幅度和频率的增加，而未注射的MF6中仍观察到增强。

**3.6. 谷氨酸受体激活引起Ca²⁺依赖性谷氨酸敏感性增加**
在MF4上通过离子电渗施加谷氨酸脉冲（0.2 Hz测试脉冲，10 Hz或2 Hz条件脉冲）。条件刺激后，gEPSP幅度显著增加；去除细胞外Ca²⁺（含EGTA）后，增强消失。在0.5 mM Ca²⁺条件下，2 Hz条件刺激仍引起增强，但加入钙调蛋白抑制剂TFP或CaMKII抑制剂KN-93后增强被阻断。

**结论与讨论**
研究结论表明，果蝇幼虫NMJ中短暂高频刺激可导致量子大小增加，该效应依赖于突触后Ca²⁺升高，并通过CaMKII激活提高谷氨酸敏感性。该增强现象在多个肌纤维和运动终末中普遍存在，且可能在体内正常运动活动中发生。尽管突触稳态机制存在，但本研究未发现量子大小增加被稳态补偿的证据。此外，电极重穿刺引起的肌纤维输入电阻下降可能源于Ca²⁺激活的K⁺电导。光电生理实验显示，Is和Ib终末均表现出量子大小增强，且增强与突触后Ca²⁺信号相关。BAPTA注射实验表明，短暂刺激引起的量子大小和频率增加均依赖于突触后Ca²⁺，而长时间刺激可能因BAPTA饱和而失效。谷氨酸离子电渗实验证明，重复谷氨酸激活可诱导Ca²⁺依赖性谷氨酸敏感性增加，且该过程需要钙调蛋白和CaMKII。因此，活动依赖性量子大小增加是果蝇NMJ突触可塑性的一个快速、普遍机制，可能通过突触后CaMKII调控谷氨酸受体功能实现。