基于邻近限制DNA行走与纳米酶级联反应的多重尿液细胞外囊泡表型分析及机器学习辅助的疾病分层方法

《Biosensors and Bioelectronics》：Proximity-Confined DNA Walking-Nanozyme Cascades for Multiplexed Urinary Extracellular Vesicle Phenotyping and Machine Learning-Assisted Disease Stratification

　　摘要：尿液细胞外囊泡可作为无创生物标志物用于液体活检，因为它们能够反映与疾病相关的分子变化。然而，在复杂的生物基质中准确分析低丰度的uEV表面蛋白仍是一项重大的分析挑战。在此，我们报道了一种邻近激活双级联（PADC）生物传感平台，该平台将目标响应型3D DNA机器与纳米酶介导的比率转换电路相结合，以实现uEV的高保真多重表型分析。当目标uEV被双重识别后，DNA机器会在单个磁粒子上发生邻近诱导的空间限制，从而形成局部催化微环境，显著提高DNA行走动力学和信号放大效率。结合酶-纳米酶氧化还原级联反应，这种受限的催化过程可产生强烈的比率荧光输出，实现灵敏可靠的分子特征分析。得益于这种空间限定的放大结构，所提出的平台能够超灵敏地同时检测CD63、EGFR和PAK6，其检测限分别可达4.3×10^4、2.2×10^4和1.7×10^3个粒子/毫升。重要的是，目标uEV的反应强度比常见尿液干扰物或其混合物产生的反应强度高约六倍，显示出在复杂尿液基质中的高分析选择性。为进一步评估其在多疾病筛查中的通用性，我们对从健康对照组、糖尿病患者和前列腺癌患者身上采集的临床uEV样本进行了多维度分子特征分析，并结合机器学习算法进行分析。最优分类模型在区分健康组、糖尿病组和前列腺癌组方面的总体多类诊断准确率达到了91%。这项工作建立了一种邻近限定催化生物传感策略用于uEV的多重分析，展现了其在基于uEV的液体活检及疾病分层中的应用潜力。

引言：液体活检作为一种非侵入性的疾病诊断和精准医疗策略，因其可通过最小限度的采样动态监测与疾病相关的分子变化而备受关注（Mattox等人，2019；Wu, L.等人，2021；Yu等人，2022）。在各种液体活检生物标志物中，细胞外囊泡，尤其是尿液细胞外囊泡，由于其优异的生物相容性、内在的分子稳定性以及能够封装来自其母细胞的与疾病相关的生物分子信息而受到广泛关注（Li, Q.等人，2024；Zhang等人，2024）。重要的是，uEV可以无创且持续地收集，这使其特别适合用于疾病的长期监测和临床筛查应用（Li, Y.等人，2025）。与血液来源的生物标志物相比，uEV更适用于肾脏和泌尿系统疾病的评估，因为它们能够直接反映泌尿系统中的病理变化。越来越多的证据表明，带有标记的uEV亚群与多种病理过程密切相关，包括代谢紊乱、炎症和肿瘤进展，从而为疾病的分类和精准诊断提供了有价值的分子特征（Sun等人，2025；Wei等人，2026；Wu, N.等人，2021）。尽管具有这些优势，但对低丰度uEV表面蛋白的准确分子特征分析仍然具有很大的分析难度（Li, N.等人，2025）。在临床样本中，特定疾病的uEV亚群通常存在量极少，而且周围是含有大量干扰性生物分子的复杂生物基质（Khoo，2024；Zhao等人，2025；Zhou等人，2020）。更关键的是，许多病理状态表现出部分重叠的分子特征，这使得单一生物标志物的分析不足以实现可靠的疾病鉴别（Ma等人，2026；Wu等人，2025）。因此，具有高灵敏度、特异性和定量稳健性的uEV表面标志物多重表型分析已成为基于EV的液体活检领域亟待解决的关键问题。为了解决这一问题，人们已经开发出了多种信号放大策略，包括杂交链式反应（HCR）（Wang等人，2025）、催化发夹组装（CHA）（Li, X.Y.等人，2024）、滚环扩增（RCA）（Xu等人，2023）、CRISPR辅助扩增以及DNA纳米机器，用于EV生物传感（Chen等人，2025）。其中，DNA行走系统因其可编程性、自主催化行为以及出色的信号放大能力而备受关注（Wang等人，2022；Zhang, X.等人，2023）。然而，大多数现有的DNA行走系统主要依赖于体相溶液中的随机分子扩散，这往往导致反应效率低下、行走动力学缓慢以及催化碰撞频率不足，尤其是在目标浓度极低的情况下（Song等人，2022；Wang等人，2023；Wang等人，2022）。在uEV分析中，这一局限性更为明显，因为只有少量囊泡可能携带目标标记，且识别事件必须高效地转化为可检测的信号。因此，传统基于DNA行走的EV生物传感器在复杂的临床环境中的放大效率和诊断稳健性仍然受到限制。从反应动力学的角度来看，空间限制作为一种有效策略，可以通过提高局部反应物浓度并减少扩散限制来加速局部催化反应（Chen等人，2019）。受此概念启发，邻近诱导的限制结构有可能将随机的分子间扩散转化为局部催化放大，从而显著提高反应动力学和分析灵敏度（Zhai等人，2021；Zhao等人，2020）。这样的设计在机制上不同于传统的3D DNA行走器，因为目标并非仅仅引发链置换或核酸酶切割，而是将行走组件物理地组织到受限的反应微环境中。尽管如此，将空间限定的DNA行走与多重EV表型分析相结合的研究还相对较少。更重要的是，邻近触发限制是否能够提高在复杂生物基质中低丰度uEV特征分析的诊断准确性，目前还没有系统的研究。与此同时，纳米酶介导的催化传感因其可调的催化活性、结构稳定性以及与多种信号转导机制的兼容性而成为一种强大的分析工具（Liu等人，2019；Zhang等人，2026）。特别是比率荧光策略能够有效降低环境波动和仪器差异带来的影响，从而提高分析的可靠性和定量稳健性（Li, M.等人，2025；Zhang, J.等人，2023）。因此，将邻近限定的催化放大与纳米酶介导的比率转换相结合，或许能为临床相关uEV表型的高保真多重分析提供一条有前景的途径。鉴于不同病理状态之间存在显著的分子异质性，结合机器学习辅助分析的多维度分子特征分析为解读复杂的与疾病相关的EV特征提供了一个有希望的框架（Liu等人，2025）。特别是，代谢紊乱和恶性肿瘤往往表现出部分重叠的细胞外囊泡特征，这就需要通过多重分子特征分析而非单一标记检测来实现更准确的疾病诊断（Lange等人，2025）。因此，将多重uEV特征分析与机器学习算法相结合，有助于更准确地实现疾病分层，并提高临床液体活检中复杂生物分子模式的可解释性。在此，我们开发了一种邻近激活双级联（PADC）生物传感平台，该平台将目标响应型3D DNA机器与协同作用的酶-纳米酶氧化还原电路相结合，用于uEV的高保真多重表型分析（图1）。在该设计中，目标uEV是通过在磁支架上的双重亲和力策略被识别出来的。磁珠被功能化为胆固醇修饰的捕获探针（CP-1）和碱性磷酸酶标记的DNA锚定链（AS）。胆固醇修饰的捕获探针通过胆固醇基团的疏水插入作用自发地锚定在uEV的磷脂膜上，从而为囊泡结构提供膜定向识别模块（Zhao等人，2020）。与此同时，另一种自由的Walker探针（CP-2）则在一端被设计为抗体，用于特异性识别囊泡表面蛋白，另一端则为行走链，用于与ALP轨道探针发生杂交。由于动力学限制，只有当胆固醇修饰的捕获探针和带有抗体的DNA Walker探针同时识别同一个uEV时，DNA Walker才能被有效地招募到磁支架上。这种双重识别事件使得行走链与束缚在磁珠上的ALP轨道探针处于极近的空间距离，从而将uEV表面特征转化为邻近限定的核酸反应。行走链与ALP轨道探针之间的邻近诱导杂交形成了一个平末端双链结构，进而激活了外切核酸酶III（Exo III）介导的切割反应。Exo III会持续消化杂交后的轨道链，并从磁珠表面释放出碱性磷酸酶标记的DNA片段（ALP-DNA），同时行走链也会重新生成，从而启动后续的切割循环。这种酶辅助的DNA行走过程使得在空间限制条件下能够实现高效的上游信号放大（图1A）。经过磁分离后，释放出的ALP-DNA片段通过催化抗坏血酸2-磷酸的脱磷酸化反应，生成抗坏血酸，进而引发下游的氧化还原级联反应。生成的抗坏血酸能够调节CoOOH/g-C3N4纳米杂化的氧化还原状态，从而调控其针对邻苯二胺的氧化催化活性（图1B）。最终，该系统基于g-C3N4和氧化后的邻苯二胺的双重发光特性，产生自校准的比率荧光信号。为了证明这一策略的临床应用价值，我们构建了一个针对CD63、EGFR和PAK6的三标志物检测面板，用于uEV的多维度特征分析。通过机器学习算法对这些分子特征进行解析，PADC平台能够准确区分健康对照组、糖尿病患者和前列腺癌患者（图1C）。总体而言，这项工作建立了一种用于多维度uEV特征解析的邻近限定分析框架，为无创疾病监测和精准诊断提供了一种有前景的工具。