《Applied and Environmental Microbiology》：Development of a GFP-labeled Pasteurella multocida strain for in vivo organ infection tracing using a stable RCR-based genetic manipulation plasmid
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显微镜技术的进步使得体内病原体追踪方法在细菌致病机制研究中得到广泛应用。多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）是一种主要的人畜共患病原体，可引起牲畜严重呼吸道疾病。然而，由于缺乏稳定的遗传工具，临床猪源分离株的遗
显微镜技术的进步使得体内病原体追踪方法在细菌致病机制研究中得到广泛应用。多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）是一种主要的人畜共患病原体，可引起牲畜严重呼吸道疾病。然而，由于缺乏稳定的遗传工具，临床猪源分离株的遗传操作仍受到阻碍，导致缺乏基因工程改造的体内追踪菌株，限制了P. multocida感染动态的研究。在本研究中，研究人员评估了多种复制机制，并发现滚环复制（rolling circle replication，RCR）型复制子（replicon）在猪源分离株中表现出优越的转化稳健性。利用温度敏感的pSET4s骨架和优化的mpheS反选择标记（counter-selection marker），研究人员开发了一种高效的无标记遗传操作系统。该系统在多种临床猪源分离株中表现出高拷贝数，并显著提高了转化产量。为验证基因敲除效率，研究人员对荚膜生物合成基因hyaD和hyaE进行了无标记缺失。表型鉴定表明，透明质酸（hyaluronic acid，HA）缺乏导致小鼠模型中毒力完全减弱。此外，研究人员通过位点特异性基因敲入构建了15-Pm::GFP报告菌株，未对细菌生长或毒力产生可检测的影响。该菌株可通过荧光成像直接观察肺部及肝脏中的细菌定植，并实现对病原体与库普弗细胞（Kupffer cell）相互作用的实时原位监测。总之，研究结果为猪源P. multocida建立了一套有效的遗传工具包，并开发了用于体内追踪的荧光标记菌株。该质粒为研究P. multocida的致病机制和体内感染动态提供了有用的工具。
重要性：P. multocida是对全球动物健康的关键威胁，而猪源分离株的遗传修饰困难阻碍了基因组与致病表型之间的联系。本研究提供了一种高效、基于RCR的无标记操作系统，并针对猪源分离株优化了跨血清群（cross-serogroup）适用性。该质粒在15株临床猪源分离株中得到验证，为遗传分析和下一代疫苗的合理设计提供了稳健的工具。通过确定hyaD和hyaE的必要作用，研究人员证明透明质酸荚膜是毒力和肺部定植所必需的。此外，具有生物学活性的荧光报告菌株的开发实现了感染动态的高分辨率原位追踪，为P. multocida感染过程中的实时可视化提供了强大工具。
**论文解读文章**
**研究背景与问题**
多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，P. multocida）是一种重要的人畜共患病原体，可导致人类、家畜和家禽的多种呼吸道疾病。根据荚膜和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）抗原，P. multocida被分为五个荚膜血清群（A、B、D、E、F）和16个LPS血清型。其中，血清群A在不同宿主中流行率最高，是猪肺炎、禽霍乱和兔鼻炎的主要病因，给全球畜牧业造成巨大经济损失。血清群A的荚膜由透明质酸（hyaluronic acid，HA）组成，与化脓性链球菌的荚膜结构相同，有助于免疫逃逸和组织定植。尽管高通量基因组测序已阐明猪源P. multocida的复杂遗传景观，但针对临床猪源分离株的功能基因组研究仍滞后。目前缺乏通用的基因编辑工具包来评估毒力机制。虽然已有针对禽源P. multocida改造的质粒，但临床猪源分离株间的转化效率和质粒拷贝数存在显著差异。因此，亟需开发一种稳定、高效的遗传操作工具，以推进猪源P. multocida的功能基因组研究和体内感染动态追踪。
**研究内容与结论**
研究人员系统评估了不同复制子（replicon）在猪源血清群A P. multocida 15-Pm菌株中的兼容性，发现滚环复制（rolling circle replication，RCR）型复制子（如pSET4s）表现出优越的转化能力，而肠杆菌科来源的θ型复制子无法获得转化子。利用温度敏感的pSET4s骨架和优化的mpheS反选择标记（counter-selection marker），研究人员构建了高效的无标记遗传操作系统pSET4s-mPheS。该质粒在10株血清群A和4株血清群D临床猪源分离株中均实现转化，其中血清群D菌株需经肝素酶III（heparinase III）消化荚膜后方可转化。通过该系统，研究人员成功构建了荚膜生物合成基因hyaD和hyaE的无标记缺失突变株，并证实透明质酸（HA）缺乏导致菌落形态由黏液型变为粗糙型，体外生长进入平台期后密度显著降低，HA含量大幅下降，且在小鼠模型中完全丧失毒力，无法引起肺部病变和全身感染。进一步，研究人员通过位点特异性基因敲入将gfp表达盒整合至15-Pm基因组中，构建了15-Pm::GFP报告菌株。该菌株在平板、流式细胞术和荧光显微镜下均表现出强荧光信号，且不影响细菌体外生长、毒力及器官定植能力。在体内追踪实验中，15-Pm::GFP可在小鼠肺部肺泡腔和肝脏坏死灶边缘清晰成像，并通过活体共聚焦显微镜实时观察到细菌在注射后10分钟内被肝脏库普弗细胞（Kupffer cell）捕获。该研究为猪源P. multocida建立了有效的遗传工具包，并开发了荧光标记菌株用于体内追踪，为研究P. multocida的致病机制和感染动态提供了有力工具。论文发表在《Applied and Environmental Microbiology》。
**关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术方法包括：1）基于RCR型复制子（pSET4s）的温度敏感质粒骨架构建；2）利用mpheS反选择标记（p-Cl-Phe致死系统）实现无标记基因操作；3）通过电穿孔法转化P. multocida，并优化电压参数（2500 V）；4）对血清群D菌株采用肝素酶III（heparinase III）靶向消化荚膜以提高转化效率；5）采用两步等位基因交换策略进行无标记基因敲除和敲入（包括基因缺失和gfp敲入）；6）通过流式细胞术、荧光显微镜和活体自旋盘共聚焦显微镜（spinning-disk confocal microscopy）评估荧光表达和体内追踪。样本队列来源：14株临床猪源P. multocida分离株，于2021年至2024年收集自中国不同地区。
**研究结果**
**RCR型复制子在猪源血清群A P. multocida 15-Pm中表现出兼容性**
通过电转化不同复制子类型的质粒，发现含RCR型复制子（pSET4s、pDL278、pSET2）的质粒能在15-Pm菌株中成功转化并生长，而肠杆菌科来源的θ型复制子（pACYCDuet-1、pUC19、pSHK5TS-TtAgoM2-HF）无法获得转化子。其中pSET4s因温度敏感（temperature-sensitive，Ts）的repA基因，可在28°C稳定维持、37°C快速丢失，成为理想骨架。
**基于mpheS的无标记诱变系统的建立与优化**
将sacB和mpheS反选择标记分别整合至pSET4s骨架，经评估发现sacB在15-Pm中无效（蔗糖浓度达15%仍无抑制），而mpheS系统在15 mM p-Cl-Phe下表现出剂量依赖的生长抑制。优化电转条件后，2500 V获得最高转化效率。该质粒在10株血清群A和4株血清群D分离株中均成功转化，其中血清群D菌株需经肝素酶III消化荚膜后才能获得转化子，而肠杆菌科θ型质粒pET28a即使去荚膜后仍完全受限。
**P. multocida中hyaD和hyaE缺失突变株的构建与鉴定**
利用pSET4s-mPheS质粒成功构建了hyaD和hyaE的无标记缺失突变株，并经PCR和Sanger测序验证。缺失株在TSA平板上呈现粗糙、非黏液型菌落，而原位回补株（CΔhyaD和CΔhyaE）恢复黏液型。体外生长曲线显示，缺失株在平台期密度显著降低。HA定量表明，ΔhyaD和ΔhyaE的HA含量大幅下降，回补株恢复至野生型水平。小鼠感染模型显示，野生型15-Pm在60小时内致死，而缺失株感染的小鼠存活超过7天，无肺部病变，且细菌在气管、肺、肝、脾、肾和血液中的载量极低，表明HA荚膜对毒力至关重要。
**保持毒力的GFP表达P. multocida菌株的构建**
通过将gfp表达盒（由链球菌强启动子PmanX驱动）整合至15-Pm基因组nanM与dsbD_2之间，构建了15-Pm::GFP报告菌株。PCR和测序验证成功。该菌株在蓝光激发下肉眼可见强绿色荧光，流式细胞术显示荧光峰显著偏移，荧光显微镜下单个细菌呈现强信号。体外生长曲线与野生型无显著差异，小鼠感染后致死率、肺部病变及器官细菌载量均与野生型相当，表明gfp整合不影响毒力。
**小鼠模型中15-Pm::GFP的器官切片成像与体内追踪**
通过气管滴注感染小鼠，对濒死小鼠的肺和肝脏进行冰冻切片荧光成像，显示15-Pm::GFP广泛分布于肺泡腔内，并在肝脏坏死灶边缘形成细菌簇。通过尾静脉注射感染，利用活体自旋盘共聚焦显微镜实时观察，发现细菌在10分钟内被肝脏库普弗细胞（Kupffer cell）主动捕获，实现实时原位追踪。
**讨论与结论**
讨论部分指出，RCR型复制子（pSET4s）因依赖质粒自身编码的Rep蛋白和复制起点，无需宿主特定因子，因而在猪源分离株中具有优越兼容性。血清群D菌株的转化障碍主要由荚膜和宿主防御机制（如III型限制修饰系统和CRISPR-Cas平台）引起，但去荚膜后RCR型质粒可克服限制，而肠杆菌科θ型质粒仍受内源质粒和宿主限制系统抑制。通过染色体整合构建的GFP报告菌株避免了质粒不稳定和抗生素选择压力，实现高分辨率原位成像和实时动态观察。该研究建立了高效的遗传操作工具，并提供了用于体内追踪的荧光菌株，为P. multocida的致病机制研究和疫苗设计奠定了基础。
结论翻译：总之，本研究开发的遗传操作工具成功克服了工程化临床猪源P. multocida分离株的挑战。稳定的染色体整合荧光报告菌株的构建为实时、高分辨率可视化P. multocida感染动力学提供了工具包。本研究为P. multocida关键毒力决定因子的机制解析提供了有用工具，能够实现感染动态的空间分辨分析，并支持未来关于致病机制和干预措施的研究。严格遵循动物福利伦理和减少动物使用原则，体内系统毒力评估仅针对野生型和荚膜缺失突变株，有意省略了回补株的冗余动物实验。
