《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Metasurface-enhanced surface plasmon resonance microscopy for long-term label-free monitoring of chondrocyte-biointerface dynamics under mechanical, genetic, and inflammatory perturbations
编辑推荐：
•Meta-SPRM技术可实现软骨细胞界面长期的无标记监测。•Meta-SPRM检测信号与富含细胞外基质标志物的界面区域相关。•长春碱处理可提升对细胞与基底膜接触丧失的敏感度。•剪切力、FGFBP1缺失以及M1型巨噬细胞会引发不同的界面变化趋势。•Axin2作为终点指标，可反映与
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Meta-SPRM技术可实现软骨细胞界面长期的无标记监测。
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Meta-SPRM检测信号与富含细胞外基质标志物的界面区域相关。
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长春碱处理可提升对细胞与基底膜接触丧失的敏感度。
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剪切力、FGFBP1缺失以及M1型巨噬细胞会引发不同的界面变化趋势。
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Axin2作为终点指标，可反映与Wnt/β-catenin通路相关的转录反应。
引言
椎间盘退变与慢性腰痛密切相关，是脊柱常见的退行性病变[1]、[2]、[3]。以往研究多聚焦于髓核和纤维环的病理变化，但位于椎体与椎间盘之间的软骨终板也是维持椎间盘稳态的关键结构[4]、[5]。作为典型的透明软骨，软骨终板一侧与椎体相连，另一侧与椎间盘相邻，它既有助于传递机械负荷，又是椎间盘与椎体之间物质交换的重要通道[6]。由于椎间盘的血管供应有限，营养物质输送及代谢产物排出主要依靠与终板相关的运输途径，而软骨终板的结构与功能变化往往与椎间盘退变的程度密切相关[7]、[8]。从组织学上看，软骨终板退变通常表现为细胞外基质的成分和结构改变，尤其是蛋白聚糖含量下降以及胶原网络受损[9]、[10]。
软骨终板软骨细胞所处的微环境受多种机械因素和炎症信号的共同影响，而非单一因素作用。机械负荷是最直接的外部刺激：日常活动中的应力-应变变化会促使间质液流动，产生剪切力相关的信号，这些信号能够调控软骨细胞的黏附能力、形态以及基质代谢[11]、[12]。随着退变进程的推进，炎症信号的作用日益显著，旁分泌的炎症介质可以改变转录活性并影响细胞外基质的更新速度[13]、[14]。这些影响最初通常会体现在细胞与基底膜/细胞外基质的界面处，表现为细胞附着稳定性的变化、细胞伸展或收缩状态的改变，以及界面连接的重新排列。因此，了解界面动态对于理解软骨终板的退变过程至关重要。
在分子调控网络中，Wnt/β-catenin信号通路与软骨稳态密切相关[15]。该通路在软骨的发育与维持过程中起着核心作用，而在病理状态下，其异常激活常常会导致软骨细胞表型改变以及基质降解现象[16]、[17]、[18]。因此，通过多因素刺激来检测与Wnt/β-catenin通路相关的转录输出，是一种有效的分子检测方法。Axin2是该通路的已知下游靶标，常被用作反映Wnt/β-catenin通路相关转录活动的替代指标[19]、[20]。
目前的研究在揭示长期界面反应方面仍存在诸多局限。免疫染色、Western blotting和定量实时PCR等终点检测方法虽然能够确定细胞的最终状态，但难以展现界面反应随时间的变化规律[21]、[22]。界面行为往往具有阶段性特征，黏附结构的改变可能仅发生在早期或短暂的时间窗口内，单次采样很容易错过这些变化。而长期成像则通常需要使用外源标记物，这类标记物可能会带来光毒性或信号衰减问题[23]。传统的明场显微镜或相位对比显微镜对细胞与基底膜界面处的细微变化灵敏度较低[24]、[25]。此外，多种因素共同作用的情况往往需要在独立的实验体系中分别研究，这不利于不同条件下的精准比较。
表面等离子体共振技术对传感器表面的折射率变化极为敏感，能够以无标记的方式检测界面事件[26]。因此它被广泛用于动态监测细胞黏附以及细胞与基底膜的相互作用[27]。基于这一原理，超表面等离子体共振传感器能够进一步提升局部场强和成像对比度，从而实现基于超表面增强的表面等离子体共振显微镜技术，用于长期界面成像[28]。在本研究中，我们构建了一种基于Meta-SPRM的细胞检测平台（见图1）。为了进行生物力学刺激，该芯片与基于灌注的剪切力加载装置相结合，以提供可控的剪切力输入；为了模拟炎症微环境，则使用了独立的静态培养模块，加入经巨噬细胞处理的培养基，使细胞暴露于与炎症相关的可溶性因子中（见图1a）。通过Meta-SPRM成像技术，我们可以持续监测界面信号以及细胞伸展状态随时间的变化，进而对界面动态进行定量分析（见图1b）。在固定的刺激时间点，我们会收集细胞样本进行qPCR分析，以Axin2的表达作为终点指标[29]、[30]。此处所说的生物界面，指的是由软骨细胞、与基质相关的成分以及具有纳米结构的Meta-SPR传感表面共同构成的近表面区域。这种纳米结构化的等离子体基底可作为与细胞相容的生物界面，用于无标记地监测软骨终板软骨细胞中与退变相关的细胞-基质重构过程。此前的SPR成像和SPR显微镜研究已经证明，该方法能够无标记地观察活细胞与细胞外基质或细胞与基底膜界面的相互作用[31]、[32]。在此基础上，本研究利用超表面增强的传感基底，探究在机械、遗传及炎症因素作用下，软骨细胞如何重构其与基质之间的界面。通过分析时间分辨的Meta-SPRM信号、细胞外基质标志物的分布情况以及Axin2的表达水平，本研究旨在全面了解活体生物界面的动态变化，以及与软骨终板退变相关的基质重构和分子机制。
章节摘要
试剂与仪器
抗II型胶原蛋白抗体购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 Junction公司）；抗聚集蛋白聚糖抗体购自Proteintech Group, Inc.（中国武汉）；抗FGFBP1抗体、抗GAPDH抗体以及HRP标记的二次抗体均购自ABclonal Biotechnology Co., Ltd.（中国武汉）。胰蛋白酶-EDTA溶液（浓度为0.25%）、磷酸盐缓冲盐水、Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient Mixture F-12培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素等试剂也一并使用。
验证Meta-SPRM技术在实时监测软骨终板软骨细胞界面变化中的应用
为评估Meta-SPRM技术用于实时监测软骨终板软骨细胞界面变化的可行性，我们研究了Meta-SPRM检测信号与关键细胞外基质成分——即作为软骨基质完整性标志物的II型胶原蛋白和聚集蛋白聚糖——之间的空间相关性[35]。
图2a展示了在MetaSPR传感器上培养的活体软骨终板软骨细胞的原始光学图像，该图像表明传感器表面能够为软骨细胞提供适宜的培养环境。
结论
本研究表明，Meta-SPRM技术是一种可靠的无标记方法，可用于长期、定量地监测软骨终板软骨细胞界的动态变化。Meta-SPRM检测信号与II型胶原蛋白、聚集蛋白聚糖等关键细胞外基质标志物在空间分布上高度一致，这一结果证实了Meta-SPRM检测结果与细胞外基质的关联性，也证明了该技术可用于监测与基质相关的界面变化。在梯度剪切力作用下，软骨细胞会发生相应的结构与功能调整。
利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何可能影响本研究结果的利益冲突或个人关系。
数据可用性
如需获取支持本研究结论的相关数据，可向通讯作者提出合理请求后获取。
CRediT作者贡献说明
杨一辉：方法学研究。李丁：方法学研究。陈友谦：方法学研究。王琼：实验执行、数据整理。顾晓峰：方法学研究、统计分析。陈明谦：方法学研究、统计分析。徐强：方法学研究。李振宇：资源协调、方法学研究、资金申请。胡文军：论文撰写与修订、资金申请、研究构思。王俊芳：论文撰写与修订、资源协调、资金申请。李文：论文初稿撰写、方法学研究、实验执行。
利益冲突声明
所有作者均声明不存在任何可能影响本研究结果的已知利益冲突或个人关系。
致谢
本研究得到了以下机构的支持：中国国家自然科学基金（项目编号：32471472、82072735）、严重人畜共患传染病诊治国家重点实验室（项目编号：2024ZZ10007、2024ZZ00019）、中国国家重点研发计划（项目编号：2024YFC2510203）、中央高校基本科研业务费（项目编号：2020kfyXJJS113）、广州国家实验室重大项目（项目编号：GZNL2023A03006）、湖北省重大专项（项目编号：2023BAA011），以及基础研究相关资助项目。
李文|王琼|顾晓峰|陈明谦|徐强|李丁|陈友谦|杨一辉|李振宇|胡文军|王俊芳
