基于CatBoost和Bootstrap不确定性量化方法的机器学习辅助优化蚕豆叶片组织中绿色L-DOPA的提取

《Computational Biology and Chemistry》：Machine Learning-Assisted Optimization of Green L-DOPA Extraction from Faba bean ( Vicia faba L.) Leaf Tissues Using CatBoost and Bootstrap-Based Uncertainty Quantification

　　•在首批报道的利用全因子设计进行豆科植物叶片组织中L-DOPA提取的机器学习辅助多因素优化方法中，共有792组观测数据，涉及264种不同条件。•10%体积比的柠檬汁加上A1:100的S/L比例、超声处理以及10分钟的提取时间，能够获得最高的L-DOPA含量预测值，为47,127 μμg/g DW，90%置信区间为38,450-53,241，这一结果优于传统的盐酸提取介质。•S/L比例是影响提取效果的最主要因素（SHAP值为3099 μμg/g DW），而提取时间则没有显著影响（KW p值为0.31），因此实际操作中的提取时间可简化为10分钟。•经过Optuna优化的CatBoost模型性能略优于未优化的基准模型（R2值为0.774，而基准模型为0.746）；该分析流程具有确定性，重新运行时能得到相同的结果，且CatBoost基准模型被指定为用于SHAP分析、自举法以及优化计算的唯一模型。•通过自举法进行不确定性量化（B值为200）并结合SHAP可解释性，形成了一个可重复、可直接应用的优化框架，同时还配有开放获取的Streamlit界面。

引言
帕金森病是全球第二常见的神经退行性疾病，患病人数超过850万（世界卫生组织，2022年）。该病的病理特征是黑质致密部中的多巴胺能神经元逐渐丧失，从而导致纹状体中的多巴胺含量下降。由于多巴胺无法穿过血脑屏障，其前体物质L-3,4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA）可通过大型中性氨基酸转运蛋白高效转运，因此成为治疗帕金森病的标准药物（Hauser等人，2007年；LeWitt，2015年）。虽然合成左旋多巴在临床上有较好效果，但长期使用会导致运动功能障碍，如运动障碍和症状波动现象（Bhidayasiri和Truong，2008年），这就促使人们开始关注天然植物来源的L-DOPA。豆科植物被认为是富含L-DOPA的天然来源之一，其种子、豆荚、花朵以及叶片组织中都含有这种儿茶酚胺（De Silva等人，2024年；Duan等人，2021年）。Nikkhah等人（2023年）证明了豆科植物提取物在帕金森病治疗中的作用与合成左旋多巴相当，这进一步凸显了建立高效L-DOPA提取方法的必要性。为了实现可靠的定量分析，需要找到能够在最大化L-DOPA回收率的同时最小化其儿茶酚结构氧化降解的提取条件，这一挑战推动了过去十年中大量关于提取优化研究的开展（Bulduk，2020年；Duan等人，2021年；Kaced等人，2024年；Polanowska等人，2019年；Tesoro等人，2022年）。传统的逐变量优化法和响应面法仅适用于连续型数值因素，而本研究中的四个提取因素——提取介质、S/L比例、预处理方式以及提取时间均为分类变量，因此这些传统方法并不适用。机器学习方法，尤其是梯度提升决策树，为处理多因素分类实验数据中的复杂非线性关系提供了有效工具。CatBoost模型（Prokhorenkova等人，2018年）专为处理分类特征设计，它无需进行独热编码，非常适合本研究的实验结构。绿色化学理念日益影响着分析提取方法的发展，人们倾向于用生物基、无毒的替代溶剂取代传统合成溶剂。新鲜柠檬汁、苹果醋以及稀释后的乙酸都是用于提取像L-DOPA这样的极性酚类物质的优质绿色提取介质，它们不仅具有较低的pH值，能够抑制多酚氧化酶的活性，还具备食品级安全性，同时可能含有具有抗氧化作用的成分。尽管人们对绿色提取方法越来越感兴趣（Vilairat等人，2023年），但目前尚无系统性的研究比较天然酸性提取介质与合成酸性提取介质在提取L-DOPA方面的效果。

本研究的目标包括：（i）针对豆科植物叶片组织中L-DOPA的提取，构建一种基于全分类因子的全因子设计的机器学习辅助多因素优化框架，以弥补传统逐变量优化法和响应面法在处理分类变量时的不足；（ii）定量比较天然绿色提取介质（柠檬汁、苹果醋）与合成酸性提取介质（盐酸、乙酸）在提取L-DOPA方面的效果；（iii）运用CatBoost模型结合SHAP可解释性功能，识别并排序各提取因素对提取效果的影响程度；（iv）通过自举重采样方法量化预测的不确定性，从而帮助选择更为可靠、风险更低的提取条件；（v）建立一个完全可重复的、具有确定性参数设置的分析流程，该流程能够精确显示整个提取设计空间中每种条件的不确定性，并以开放获取的形式提供一个决策支持界面。据我们所知，这是首批将CatBoost模型与自举法不确定性量化技术相结合，用于豆科植物叶片组织中L-DOPA提取优化的研究之一。

相关内容片段
豆科植物中的L-DOPA：分布及其药理意义
早在Guggenheim早期进行研究时（Guggenheim，1913年），豆科植物就已被视为L-DOPA的天然来源，而Hornykiewicz则进一步确定了该化合物在帕金森病治疗中的重要作用（Hornykiewicz，2002年）。在过去的二十年里，人们已经系统地研究了豆科植物不同组织中L-DOPA的存在情况。Duan等人（2021年）研究了不同生长阶段的豆科植物组织中L-DOPA的积累情况，发现……

植物材料与样品制备
本研究共使用了10个豆科植物品种，这些植株在印度贾坎德邦兰契市的ICAR-印度农业生物技术研究所的农场B中，在受控的农业条件下生长（纬度23.27°北，经度85.33°东，海拔663米）。从生长60至80天的植株上采集幼叶，将其置于阴凉处晾干，然后磨成细粉，并通过100目筛网过滤，确保粉末的粒径均小于150 μμm。处理后的样品在4℃下保存，直至进行分析。所有实验均使用HAVFB-06基因型的植株。

数据集概览与描述性统计
该数据集包含792组L-DOPA含量检测数据，其平均值为28,679 ± 7,805 μμg/g DW，范围在1,926-55,746 μμg/g DW之间，变异系数为27.2%。该数据的分布呈轻微左偏态（图1A），偏度为-0.69，峰度为0.91，Shapiro-Wilk检验结果显示数据不服从正态分布（W值为0.949，p值小于0.001）。Ramsey RESET检验也表明数据存在显著的非线性特征（F值为47.3，p值小于0.001）。在各种提取介质中（见表1；图1B），0.05 N浓度的盐酸和20%浓度的柠檬汁所对应的L-DOPA平均含量最高，分别为34,351 μμg/g DW和34,240 μμg/g DW，其次是……

提取介质：天然酸性介质与合成酸性介质的比较
本研究对从豆科植物叶片组织中提取L-DOPA的绿色（天然酸性）提取介质与传统（合成酸性）提取介质进行了系统的多因素机器学习辅助比较。结果表明，10-20%体积比的柠檬汁以及0.05-0.1 N浓度的盐酸是效果最好的提取介质，它们能使L-DOPA的平均含量达到30,393-34,351 μμg/g DW，而在特定条件下，其预测的最高含量甚至可达47,127 μμg/g DW，具体条件为：10%浓度的柠檬汁、A1:100的S/L比例、超声处理以及10分钟的提取时间。低pH值在抑制多酚氧化酶活性以及稳定L-DOPA的儿茶酚结构方面发挥着重要作用。

结论
本研究提出了一种基于机器学习的全面优化框架，用于提高从豆科植物叶片组织中提取L-DOPA的效率。主要结论如下：在所研究的四个提取因素中，S/L比例是CatBoost模型中影响L-DOPA提取量的最重要因素（SHAP值为3099 μμg/g DW），较高的稀释比例（A1:100）往往能带来更高的提取效率；提取介质和预处理方式虽为次要因素，但也具有非常重要的影响作用。

未来研究方向
下一步应通过对最优提取条件进行独立的实验验证，包括已确定的最佳条件——10%浓度的柠檬汁、A1:100的S/L比例、超声处理以及10分钟的提取时间，通过重复的实验室实验以及使用不同来源的植物材料在不同生长季节进行的外部验证，进一步确认这些条件的有效性。未来的研究还可以拓展到其他天然酸性提取介质（如罗望子、石榴汁、发酵液等）以及不同的超声处理参数。此外，还可以针对不同品种的豆科植物开展相关研究。

局限性
在全因子设计中，针对最优提取条件（10%浓度的柠檬汁、A1:100的比例、超声处理以及10分钟的提取时间）进行的三次生物学重复实验均证实了该条件的优越性，其平均L-DOPA含量为55,337 μμg/g DW，变异系数仅为0.86%；不过，若能在独立的实验室中使用不同来源的植物材料以及不同生长季节的样本进行外部验证，将进一步增强研究结果的普遍适用性。目前这些模型是基于单一生长季节和地点的数据训练而成的，这限制了其应用范围。

资金支持
本研究得到了印度农业研究委员会的支持，该机构位于印度新德里，同时也是ICAR-印度农业生物技术研究所的所属机构。

作者贡献说明
Vasundhara Dhote：负责方法学设计及数据整理工作。Sandip Garai：负责撰写原始稿件、数据可视化、结果验证、软件开发、方法学研究、正式数据分析以及概念构思工作。Mohammad Danish Jawed Ansari：负责撰写原始稿件、结果验证、方法学研究以及数据整理工作。Sujay Rakshit：负责文章的审阅与编辑工作，同时承担监督职责。Vijai Pal Bhadana：负责文章的审阅与编辑工作，同时承担监督职责。Sujit Kumar Bishi：负责文章的审阅与编辑工作，同时承担监督职责、项目管理工作、方法学研究以及相关调查工作。

利益冲突声明
作者声明自己不存在任何可能影响本研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢
衷心感谢印度农业研究委员会以及印度农业与农民福利部下属的农业研究教育司所提供的财政与制度支持。

数据与软件提供情况
完整的数据库文件（data_final.csv，共792条数据）、已训练好的模型文件（linear_regression.pkl、random_forest.pkl、catboost_model.cbm、CatBoost_Final_Optuna.cbm）、分析脚本文件（basic.py）以及Streamlit应用程序文件（app.py）均可在此处获取：//github.com/SandipGarai/ldopa-optimization-dashboard

作者名单：Mohammad Danish Jawed Ansari | Sandip Garai | Vasundhara Dhote | K.K. Kanaka | Vijai Pal Bhadana | Sujay Rakshit | Rakesh Kumar Sinha | Sujit Kumar Bishi