《Current Opinion in Structural Biology》：Recent advances in cryoelectron tomography and applications to parasitology
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冷冻电子断层扫描技术已成为一种重要的分析手段，可用于观察真核寄生虫从蛋白质到细胞结构的天然超微结构。在样品制备、数据采集以及计算分析方面的最新技术进展，使得人们能够以前所未有的深度了解具有医学重要性的病原体的结构细胞生物学特性，这些病原体包括刚地弓形虫、恶性疟原虫、布鲁斯锥虫和克
冷冻电子断层扫描技术已成为一种重要的分析手段，可用于观察真核寄生虫从蛋白质到细胞结构的天然超微结构。在样品制备、数据采集以及计算分析方面的最新技术进展，使得人们能够以前所未有的深度了解具有医学重要性的病原体的结构细胞生物学特性，这些病原体包括刚地弓形虫、恶性疟原虫、布鲁斯锥虫和克鲁兹锥虫、小隐孢子虫以及微孢子虫。本综述以真核寄生虫为研究对象，介绍了冷冻电子断层扫描技术所能达到的分辨率范围及可揭示的生物学信息。低分辨率数据（20–30 ?）能够提供关于细胞器、完整细胞以及细胞间相互作用的结构信息；而高分辨率模式下，则可通过亚断层平均技术实现近乎原子级别的结构解析，这类技术通常用于分析核糖体等大型且数量众多的粒子。结合其他互补技术，冷冻电子断层扫描堪称研究寄生虫结构细胞生物学的强大工具。
引言
低温电子断层扫描技术是一种能够获取生物样本接近天然状态结构信息的强大工具。传统上，细胞样本的超微结构信息是通过室温透射电子显微镜或室温体积电子显微镜技术获得的[1]。使用室温电子显微镜时通常需要通过化学固定或高压冷冻来保存超微结构，之后还需进行冷冻替代处理。随后样品要经过染色、脱水、树脂包埋以及机械切片等步骤，而这些操作往往会对样品造成干扰，引入伪影，从而限制所能达到的最高分辨率。相比之下，用于冷冻电子断层扫描的样品是通过 plunge冷冻或在毫秒级时间内快速玻璃化处理来制备的，且在成像过程中样品会被维持在低温状态，这样就能将生物标本保持在水合且接近天然的状态。对于那些厚度过大而无法直接通过透射电子显微镜成像的标本，则需通过低温聚焦离子束技术制备出薄片。虽然低温聚焦离子束铣削造成的样品变形比机械切片更小，但仍然会存在一些由聚焦离子束带来的损伤，如何理解这些损伤对样品质量及重建分辨率的影响是当前研究的热点之一[2,3]。对于那些刚接触冷冻电子断层扫描技术的人而言，图1展示了该技术的全流程，不过这一流程的许多方面仍在快速发展中。目前的瓶颈主要在于如何从噪声较大的二维图像中处理数据以提取高分辨率的三维信息（即准确识别出感兴趣的粒子或物体），其次是样品制备技术。虽然常规工作的数据采集流程已经相当成熟，但由于有时难以确定特定位置的倾斜序列，导致数据处理速度低于针对单粒子样本的冷冻电子显微镜成像速度。Asarnow等人以及Lemos等人最近的综述中概述了该技术在某些传染病研究中的应用以及流程方面的技术进展[4,5]。
近年来，冷冻电子断层扫描技术取得了显著进展（见表1）。在样品制备方面[6,7]，现在有了诸如连续提取技术之类的新方法[8??, 9, 10]。断层图像的采集速度[11]也有了极大提升——过去每组倾斜序列的采集时间长达数十分钟，而现在每张断层图像的采集时间已缩短至5分钟以内，这主要得益于PACE-tomo[12]这类新型采集策略，以及基于人工智能的SPACEtomo[13]版本。此外，在数据处理方面，各种任务都得益于更多自动化功能以及更优的算法，比如倾斜序列对齐技术AreTomo[14,15]、断层图像重建技术cryoTIGER[16]、亚断层异质性分析技术nextPYP、cryoDRGN-ET、tomoDRGN、tomoDRGN[17, 18, 19, 20]、图像分割技术MemBrain、TARDIS、CryoVesNet、DeePiCt[21, 22, 23, 24]，以及空间分析技术TANGO[25]。不同软件包之间的兼容性问题一直是个难题，但目前已有努力致力于促进不同软件包之间的数据互通[26,27]，或是开发能够处理更多类型断层图像处理任务的流程[28, 29, 30, 31]。
章节节选
规划使用冷冻电子断层扫描技术时需考虑的因素
何时该选择冷冻电子断层扫描技术？ 冷冻电子断层扫描技术能够生成大量数据：例如，人们可以获取数百张高细节水平的目标结构断层图像。然而，在对比度较低的图像或噪声较大的断层图像中识别出感兴趣的蛋白质或结构依然是一项挑战。与光学显微镜不同，为蛋白质添加适合电子显微镜检测的标记并非易事，相关标记技术的开发目前仍是研究热点[32, 33, 34, 35, 36, 37]。因此，
不同空间分辨率下的信息含量
冷冻电子断层扫描技术可覆盖从埃级别到微米级别的多种长度尺度，因此它能够提供从近乎原子级别的蛋白质结构信息到整个细胞及其细胞间相互作用超微结构的信息。下文将通过寄生虫生物学研究中的最新案例（见图2），展示在不同长度尺度下利用冷冻电子断层扫描技术所能获得的各类信息。
冷冻电子断层扫描技术的未来应用
随着冷冻电子断层扫描技术在寄生虫学及其他领域的应用越来越普及，我们预计会在多个方面出现变化。其中一些变化包括：1）数据集规模不断扩大： 近年来，目标定位及数据采集技术的发展使得可收集的冷冻电子断层扫描数据集规模大幅增加。就在几年前，记录一组倾斜序列还需要18–35分钟[13,13,74]，而最近Kelley等人仅在42个夜间工作日内就收集到了2991组倾斜序列，效率提升了61%
作者贡献声明
N.C.、D.C.E.和G.B.负责参考文献的筛选，以及手稿的撰写与编辑工作。
致谢
我们感谢Paris Watson和Shenping Wu对手稿的细致审阅以及提出的有益意见。同时也要感谢RCSB蛋白质数据库的Justin Flatt和Chenghua Shao，以及EMPIAR的Damiano Clementel，他们为获取图3a所需的信息提供了帮助。
Nicolas Coudray|Damian C. Ekiert|Gira Bhabha
美国马里兰州巴尔的摩市北查尔斯街3400号，约翰斯·霍普金斯大学生物学系，邮编21218
