综述：蜈蚣草（Pteris vittata）中砷的超富集：根际动员、木质部转运和细胞解毒机制的综述

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Arsenic hyperaccumulation in Pteris vittata: A critical review on mechanisms of rhizospheric mobilization, xylem transport and cellular detoxification

　　

砷（As）具有致癌毒性，由于大量施用含砷农药和工业活动而广泛存在于土壤中。蜈蚣草（P. vittata）是首个被报道的砷超富集植物。利用蜈蚣草修复砷污染土壤的效率取决于根际砷动员、根部到地上部的转运（吸收和氧化还原）以及解毒（甲基化和区室化）效率。因此，更好地理解蜈蚣草如何耐受和超富集砷有助于提高修复效率和实际应用。本综述的目的在于：（1）讨论蜈蚣草和根际细菌（砷抗性、动员、As^III氧化和As^V还原）在调控土壤砷动员中的影响因素和机制；（2）阐明转运蛋白（PvPht1;1、PvPht1;2、PvPht1;3、PvTIP4;1、PvACR2、PvACR3、PvACR3;1、PvACR3;2、PvACR3;3、PvHAC1、PvAsE1、PvHAC2、PvTPI和PvGRX5）在砷（As^V、As^III、二甲基砷酸（DMA）和一甲基砷酸（MMA））吸收、转运、积累和分布中的作用；（3）识别关键基因（PvPht2;1、PvGAPC1、PvOCT4和PvGSTF1）在砷耐受和解毒中的作用。此外，提出了当前的知识空白和未来研究展望。这些信息将有助于更好地理解蜈蚣草砷耐受和超富集的转运途径及生理和分子机制，从而制定利用超富集植物或开发转基因植物高效修复砷污染环境的策略。

1. 引言

砷（As）及其氧化物具有毒性和致癌性，其毒性取决于迁移性和形态。无机砷毒性约为有机砷的100倍，其中亚砷酸盐（As^III）毒性是砷酸盐（As^V）的60倍，As^V毒性约为一甲基砷酸（MMA）和二甲基砷酸（DMA）的70倍。农业和工业活动（如木材防腐、除草剂和杀虫剂施用、含砷地下水灌溉以及采矿冶炼）导致土壤砷污染。在陆地土壤中，砷主要以氧化态As^V形式存在。As^V是磷（P）的化学类似物，因此通过根部磷转运蛋白被吸收并进入食物链。因此，高效去除土壤中的砷对于减少作物中砷积累和降低人类健康风险至关重要。

利用超富集植物进行植物修复已引起广泛关注。超富集植物能高效吸收和转运重金属至地上部分而不表现出植物毒性。蜈蚣草（Pteris vittata，P. vittata）是首个已知的砷超富集植物，可在1500 mg kg^-1砷污染土壤上生长，并将砷积累和转运至叶片（22630 mg kg^-1）。通常，普通植物中砷浓度低于10 mg kg^-1且主要储存在根部，表明蜈蚣草已进化出特定的策略来吸收、转运、积累和解毒砷。

鉴于蜈蚣草的超富集特性，过去二十年的研究主要集中在：（a）蜈蚣草与其他超富集蕨类（如P. multifida、P. cretica、P. longifolia和P. umbrosa）以及非超富集蕨类（如P. ensiformis、P. quadriaurita、P. tremula和N. exaltata）在砷吸收、转运、积累和解毒能力方面的比较；（b）As^V类似物（P）和As^III类似物（硅酸和硼酸）通过磷转运蛋白和水通道蛋白的竞争性吸收对蜈蚣草砷吸收的影响；（c）环境因素（如金属（类金属）、微量元素、养分和微生物）对砷溶解、形态转化和蜈蚣草吸收的影响；（d）蜈蚣草中砷转运和耐受的分子机制；（e）基于蜈蚣草的植物提取田间应用。

在植物修复的实际应用方面，研究集中于：（1）评估田间条件下的修复效率，考察气候、土壤理化性质（pH、质地、有机质含量）和农艺管理措施的影响；（2）探索增强提取效率的策略，如通过施用螯合剂或磷肥增加砷有效性；（3）应用间作系统将蜈蚣草与经济作物（如桑树和蓖麻）种植，以实现土壤修复和农业生产同步进行。为提高修复效率并促进蜈蚣草的实践应用，更好地理解微生物、关键基因和转运蛋白的作用有助于开发微生物辅助策略或转基因植物。

与以往综述相比，本综述全面总结了关于调控砷转运蛋白丰度、活性和定位的分子机制的新见解，包括：（1）根际过程：400种与砷抗性（203株）、砷动员（18株）、As^III氧化（92株）和As^V还原（49株）相关的根际细菌菌株及其在调控土壤砷动员中的作用；（2）根部到地上部的转运过程：负责As^III/As^V吸收、根部液泡转运和区室化、木质部装载、叶片液泡转运和区室化、根/根茎/叶片As^V还原酶以及砷代谢囊泡的关键基因和转运蛋白；（3）耐受和解毒过程：靶向解毒途径（PvGAPC1、PvOCT4和PvGSTF1）以及抗氧化剂和植物螯合肽在砷解毒和超富集中的协同作用。

2. 蜈蚣草中砷的动员和吸收

砷在土壤中与Fe/Al羟基氧化物紧密结合形成不溶性矿物，导致植物难以吸收。蜈蚣草根际中有效砷浓度高于非根际土壤，以及其高效的砷积累能力，表明蜈蚣草及其相关根际细菌已进化出独特的根际砷动员机制。

2.1. 根际中的砷动员

2.1.1. 蜈蚣草根系的动员

植物在重金属或养分缺乏胁迫下会分泌根系分泌物。超富集植物可通过根系分泌物、微生物分泌物和生物转化来溶解和动员砷。例如，无砷胁迫下，蜈蚣草根系分泌物中溶解性有机碳（DOC）浓度是非超富集蕨类波士顿蕨（N. exaltata）的2倍，在67 μM和267 μM砷胁迫下分别增加3.2倍和8倍。此外，蜈蚣草根际DOC浓度比非根际土壤高40-54%。增加的DOC分泌通过其与砷的强亲和力促进砷从稳定态向易溶态转化。由于较高的DOC，蜈蚣草根系生物量是波士顿蕨的4倍，并从根际土壤中去除的砷量多29倍。

在根系分泌物中，有机酸是最常见的组分，能有效动员养分和金属。例如，蜈蚣草分泌的有机酸可溶解胶体FePO₄以释放P和Fe，其浓度比非根际土壤高1.02-1.61倍。特别地，植酸和草酸是蜈蚣草根系分泌物中的主要有机酸（>93%）。植酸（肌醇六磷酸）是土壤和谷物中有机磷（Po）的主要储存形式。蜈蚣草根系分泌物中检测到植酸，且其分泌量比非超富集蕨类波士顿蕨高1.4-2.06倍（草酸高3.0-5.0倍）。在5 mg L^-1砷条件下，蜈蚣草分泌的植酸量是P. multifida和P. ensiformis的1.27-2.62倍。值得注意的是，砷（10-100 μM）上调植酸合成基因（MIPS、IMP和2-PGK）以及植酸转运蛋白PvMRP5的表达1.3-1.7倍，从而增加蜈蚣草组织及根系分泌物中的植酸含量1.1-3.6倍。植酸可通过植酸酶水解释放P，从而促进砷的竞争性解吸。在蜈蚣草根中鉴定出紫色酸性磷酸酶PvPAP1，其活性在添加外源植酸后增加3.3-6.5倍。

砷诱导的植酸和草酸分泌促进了砷化合物的溶解，其中植酸比草酸更有效。例如，在有机酸:FeAsO₄摩尔比为1:1时，植酸溶解的FeAsO₄比草酸多（39%对比10%）。植酸通过络合Fe³⁺形成Fe-植酸复合物来溶解FeAsO₄。此外，植酸从Al-As和Fe-As矿物中溶解的砷量分别是草酸的0.7-4.6倍和13.6-32.8倍。砷化合物的增强溶解使砷吸收量增加2.7-26倍。同时，植酸水解释放的大量P使蜈蚣草中P积累量增加1.8-2.7倍。

此外，根系分泌物通过改变根际pH来介导元素溶解。例如，蜈蚣草根系分泌的有机酸使土壤pH降低0.74-0.92个单位，促进水溶性As和P浓度增加1.2-1.4倍和2.6-3.8倍。这归因于砷矿物溶解增强，导致Fe/Al结合态砷释放。但也有研究发现蜈蚣草根际pH比非根际土壤高0.27-0.4个单位，这归因于蜈蚣草独特的养分获取策略和电荷平衡。蜈蚣草偏好吸收硝酸盐（NO₃^-）并释放OH^-/HCO₃^-以维持电荷平衡，导致pH升高。此外，蜈蚣草吸收的砷（HAsO₄^2-和H₂AsO₄^-）导致OH^-外排，从而增加根际pH，有助于砷从土壤中解吸。pH从5.0升至8.0时，有效砷浓度增加3倍，归因于OH^-增加增强了砷从矿物表面的解吸。

2.1.2. 根系分泌物招募的根际细菌的动员

除了络合反应和改变pH以溶解和解吸砷外，根系分泌物还可通过改变根际微生物群落来介导砷动员。根系分泌物维持土壤微生物的生长和活性，而微生物反过来改善植物对元素的生物有效性和利用。这种植物介导的微生物招募策略在砷胁迫下的蜈蚣草中尤为明显。例如，在0.3-0.42 mg kg^-1砷污染土壤中，蜈蚣草根际的Simpson指数和Shannon指数分别比非根际土壤高1.44-1.58倍和1.06-1.07倍，表明砷增加了微生物群落的丰度。此外，100 mg kg^-1砷使根际有机酸（甲酸、乙酸、苹果酸、草酸、琥珀酸和柠檬酸）和DOC浓度增加11.1-159%，相应地使As^V、Fe^III和SO₄^2-还原菌的丰度增加45.7-63.3%。根系分泌物中升高的DOC既作为直接的砷动员剂，又作为微生物代谢和增殖的碳源，从而形成砷溶解和转化的自我强化循环。

此外，在异质性砷分布下，蜈蚣草增加磷胆碱和N-乙酰组胺的分泌，招募特定微生物类群（KD4-96纲和Vicinamibacteraceae目），这些微生物上调砷转化基因（aioA、arsC和arrA），从而增强砷动员。同时，高砷胁迫诱导蜈蚣草根际分泌儿茶素，趋化关键固氮菌（Rhizobium sp. G5和Bradyrhizobium sp. J3）进行As^III氧化和固氮，通过促进砷吸收和植物生长来提高修复效率。

2.1.3. 微生物的动员

根际细菌介导的砷转化影响土壤砷动员和植物砷积累。蜈蚣草根际中砷抗性和砷转化细菌已被广泛鉴定和表征。

2.1.3.1. 砷抗性微生物

土壤微生物在砷溶解和形态转化中起重要作用，可被砷胁迫和砷诱导的根系分泌物富集。已报道的砷抗性根际细菌属包括Acidithiobacillus、Acinetobacter、Aeromonas、Agrobacterium、Arthrobacter、Bacillus、Bacteroidetes、Comamonas、Deinococcus、Desulfitobacterium、Exiguobacterium、Escherichia、Firmicutes、Proteobacteria、Pseudomonas、Rhodococcus和Stenotrophomonas等。在已记录的257种砷抗性微生物菌株中，变形菌门（Proteobacteria）最多（47.1%，121株），其次是厚壁菌门（Bacillota，31.1%，80株）和放线菌门（Actinomycetota，19.5%，50株）。蜈蚣草根际中砷抗性细菌的丰度比非根际土壤高1.17-22.4倍。砷胁迫使根际中变形菌门、放线菌门和绿弯菌门（Chloroflexi）的相对丰度分别增加12.3%、39.5%和143%，而拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia）和厚壁菌门的相对丰度分别降低21.6%、19%、9.8%和5.6%。

最小抑制浓度（MIC）范围：As^III为0.5-209 mM，As^V为9.6-650 mM。在所有测试菌株中，Stenotrophomonas sp.对As^III（209 mM）和As^V（564 mM）的耐受性最高，其次是Micrococcus luteus AS2（55 mM As^III和275 mM As^V）。大多数对As^V耐受性强的菌株（≥300 mM）也对As^III具有高抗性（≥10 mM），但存在例外，如Brevundimonas nasdae菌株Au-Bre29和Au-Bre30对As^V的MIC高达600 mM，但对As^III的耐受性较低（5-6.5 mM）。

2.1.3.2. 砷转化微生物

在砷抗性菌株中，包括Bacillus、Pseudomonas、Flavobacterium、Alcaligenes、Achromobacter、Agrobacterium和Stenotrophomonas等属的细菌具有As^III氧化能力，该能力由aox操纵子赋予。其中，α-变形菌NT-26的As^III氧化效率最高，最大反应速率（V_max）为2.4 μM min^-1 mg^-1蛋白。Pseudomonas、Vibrio、Enterobacter和Bacillus等属的细菌可进行As^V还原，并能耐受200 mM As^V胁迫。还原能力源于ars操纵子编码的As^V还原酶ArsC、ArsA和ArsB。Chrysiogenes arsenatis MIT-13是首个被报道的As^V还原菌株。Citrobacter sp. NC-1和Bacillus sp. SF-1表现出较强的As^V还原活性，相对还原速率分别为833和417 μM h^-1。

在蜈蚣草存在下，外源As^III（1 mg L^-1）在2周内几乎100%被氧化为As^V，而无菌对照组无氧化发生。此外，抗生素处理后As^III氧化效率从90%降至10%，证实蜈蚣草根际富含As^III氧化微生物。从蜈蚣草根际分离的Pseudomonas sp. PG5和PG12可分别氧化31-46%和6.2-21%的1 mM As^III，而Pseudomonas sp. PG6、PG9、PG10和Stenotrophomonas sp. PG16可分别还原58-95%和7.5-46%的1 mM As^V。与无机As^III和As^V不同，蜈蚣草组织中检测不到甲基化砷形态，推测植物组织中检测到的甲基化砷是在土壤中产生后经根部吸收的。

由于As^III比As^V更易迁移，微生物驱动的As^V还原增加了土壤砷有效性及蜈蚣草对砷的积累。例如，在蜈蚣草根际接种As^V还原菌（包括Comamonas sp. Ts37、Delftia sp. Ts33、Delftia sp. Ts41、Rhodococcus sp. Ts1和Streptomyces lividans PSQ22）可使叶片生物量和砷含量分别增加18-50%和6-44%。同时接种As^V还原菌株Streptomycetes F2、Streptomycetes F2-As和Comamonas C13使根际有效砷和DOC含量分别增加22.5-44.1%和15.7-20.4%，从而促进蜈蚣草生物量和砷积累分别增加14.9-51%和26.8-54.3%。此外，根际接种As^V还原菌（Bacillus sp. MPV12、Delftia sp. P2III5、Pseudomonas sp. P1III2、Pseudoxanthomonas sp. P4V6和Variovorax sp. P4III4）将土壤砷去除效率从13.6%提高到21.3-35.4%。

2.1.3.3. 砷抗性内生菌

与蜈蚣草相关的内生菌也参与砷转化。从蜈蚣草组织中分离的砷抗性内生菌主要属于变形菌门（50%）、厚壁菌门（44%）和拟杆菌门（6%），其中大多数具有As^V还原能力。例如，Bacillus sp. PVL09可还原9%的外源As^V为As^III。此外，Paraoxydans sp. R15表现出较高的As^V还原效率，而Leifsonia shinshuensis L01能高效氧化As^III，转化效率为15-17%。

由于蜈蚣草中As^III的木质部转运速率是As^V的9倍，微生物将As^V还原为As^III有利于砷的长距离转运。共从蜈蚣草根部分离出116种砷抗性内生菌，属于变形菌门、放线菌门和厚壁菌门。其中19株对As^III具有高耐受性（MIC为40 mM）。此外，ACR3(2)和arsB基因的水平转移支持微生物介导的As^V还原。尽管如此，由于分离和培养蜈蚣草内生菌的技术困难，未来需要验证其生态功能和作用机制。

2.1.3.4. 微生物介导的砷动员

蜈蚣草根际中的产铁载体细菌、解磷菌和丛枝菌根真菌（AMF）在砷动员中发挥作用。根际细菌分泌的铁载体可螯合Fe，促进Fe-As复合物中砷的溶解和解吸。例如，砷抗性菌株Pseudomonas sp. PG12产生的铁载体从FeAsO₄中动员的砷量比商业真菌铁载体去铁胺B（DFOB）高1.4-1.6倍，从而使蜈蚣草中砷积累量增加1.13倍。

解磷菌通过分泌有机酸和磷酸酶解无机磷源（如FePO₄和磷矿粉[Ca₁₀(PO₄)₆F₂]）并水解有机磷（植酸）为无机磷，释放的P通过离子交换反应与砷竞争土壤结合位点，促进砷解吸，同时为蜈蚣草提供磷营养，促进植物生长和砷积累。例如，接种解磷微生物（Penicillium sp. W186、Aspergillus sp. W196及其联合接种剂）使土壤有效砷浓度增加9.18-30.6%。从蜈蚣草根际分离的Pseudomonas sp. PG5和PG12具有较强的磷矿粉溶解能力，释放1.36-2.4 mg L^-1 P，而Pseudomonas sp. PG6从植酸中释放更多P（0.89 mg L^-1）。磷矿粉溶解产生的P使蜈蚣草生长提高20-335%，叶片砷浓度增加1.5倍。

从蜈蚣草根际分离的丛枝菌根真菌（AMF），包括Glomus属的G. brohultii、G. geosporum、G. microaggregatum和G. mosseae，表现出高砷耐受性，并通过增强根系砷内流和转运促进蜈蚣草对砷的吸收。例如，G. mosseae BGC YN05在水培条件下（1 mM As）使蜈蚣草根系砷内流增加79-128%，在100 mg kg^-1砷污染土壤中使叶片砷浓度增加31-33%。在100 mg kg^-1砷污染下，土壤接种G. intraradices和G. mosseae使砷从根部到地上部的转运增强1.03-1.58倍，地上部砷浓度增加6.76-15.8%。AMF接种诱导的根系砷内流和转运增强归因于P转运蛋白表达上调。此外，AMF通过优化植物磷状态提高蜈蚣草的砷耐受性。

总之，根际微生物和内生菌在蜈蚣草的砷转化、转运和积累中发挥重要作用，展现了高效修复砷污染土壤的潜力。然而，目前关于利用砷抗性和转化微生物增强蜈蚣草砷修复效率的研究主要局限于温室实验，田间规模修复性能及影响因素有待进一步研究。

2.2. 砷内流和吸收途径

2.2.1. As^V和As^III吸收途径

As^V作为P的化学类似物，可通过植物根部固有的P吸收系统进入。负责As^V获取的关键P转运蛋白包括高亲和力P转运蛋白1（Pht1）和低亲和力P转运蛋白B（PTB），已在多种植物中鉴定。在蜈蚣草中，四种Pht1转运蛋白（PvPht1;1、PvPht1;2、PvPht1;3和PvPht1;4）位于质膜上，对As^V具有高亲和力。这些基因主要在蜈蚣草根和叶中表达。PvPht1;1的表达响应P饥饿，而PvPht1;2、PvPht1;3和PvPht1;4在缺P或砷胁迫下上调。在缺P条件下，PvPht1;3、PvPht1;2、PvPht1;1和PvPht1;4的转录本丰度分别增加7.5、6、5和1.3倍。砷暴露下，PvPht1;1/2的转录水平降低2倍，而PvPht1;3表达增加1.5倍。PvPht1;3在烟草中的异源表达使地上部砷和磷浓度分别增加103-196%和8.8-30%。

蜈蚣草中As和P竞争性吸收，其增强的As^V和P吸收归因于双P转运系统（PTB和Pht1）。PTB蛋白在蜈蚣草中特异性表达，而在非超富集蕨类P. ensiformis中未检测到。PTB表达在pH升高条件下上调。例如，根际pH从5.0升至7.0时，PvPTB1;1/1;2的根表达上调1.9-2.9倍，从而增强根对As和P的吸收（分别增加34%和63%）。

As^III可通过甘油通道和水通道蛋白被吸收。蜈蚣草中As^III吸收主要由高亲和力液泡膜内在蛋白（TIP）