MAPK调控的肠道蛋白ALP2表达促进绿盲蝽对Mpp51Aa毒素的敏感性

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：MAPK-regulated expression of the gut protein ALP2 facilitates Apolygus lucorum susceptibility to Mpp51Aa toxins

　　

绿盲蝽（Apolygus lucorum）由于目前使用的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）棉花品种缺乏有效性以及广谱杀虫剂使用的减少，已成为一种经济危害性害虫。Mpp51Aa（Cry51Aa）蛋白是具有前景的杀虫候选蛋白，对半翅目害虫（包括A. lucorum）具有特异性活性。然而，其毒性分子机制和宿主细胞反应仍知之甚少。本研究旨在表征A. lucorum肠道对Mpp51Aa1和Mpp51Aa2毒素的时间转录组响应，并阐明丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路及其下游靶点在介导毒性中的功能作用。研究人员发现，Mpp51Aa1触发了比Mpp51Aa2更强的转录组响应，与其更高的效力相关。对MAPK信号的分析显示，Mpp51Aa毒素在转录和蛋白质水平上均增加了p38和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）的表达，但降低了c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）的表达。沉默这些通路降低了若虫死亡率，表明p38和ERK的激活促进了毒素诱导的损伤，而非其他物种中观察到的保护作用。对候选肠道蛋白的分析确定，碱性磷酸酶2（alkaline phosphatase 2, ALP2）是两种Mpp51Aa毒素的关键敏感性因子。此外，沉默p38和ERK显著降低了该下游靶点的表达。总之，Mpp51Aa毒素通过操纵A. lucorum的MAPK信号网络来反式调控ALP2的表达，从而增强毒素敏感性和致病性。这些发现为半翅目对Bt Mpp51Aa毒素敏感性的分子基础提供了重要见解。

**论文解读：MAPK调控的肠道蛋白ALP2表达促进绿盲蝽对Mpp51Aa毒素的敏感性**

**研究背景、问题与目的**

绿盲蝽（Apolygus lucorum）已成为中国重要的经济害虫。由于目前广泛种植的苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）棉花品种（如表达Cry1Ac或Cry2Ab的品种）对半翅目害虫缺乏活性，加之广谱杀虫剂使用减少，导致该虫暴发成灾。Mpp51Aa（Cry51Aa）蛋白是Bt来源的β-成孔毒素，对包括绿盲蝽在内的半翅目害虫具有特异性活性，其中Mpp51Aa1和Mpp51Aa2两个成员序列高度相似（97.7%），但毒性差异显著——Mpp51Aa1对绿盲蝽的活性约为Mpp51Aa2的5倍以上。然而，Mpp51Aa毒素的分子作用机制以及宿主细胞如何响应仍不清楚。在传统Bt毒素模型中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在昆虫中通常发挥保护作用，而Mpp51Aa毒素是否也诱导类似的防御反应，或是否存在独特的调控机制，尚待阐明。此外，碱性磷酸酶（ALP）、氨肽酶N（APN）和ABC转运蛋白等经典受体在半翅目中的作用也缺乏证据。因此，研究人员开展本研究，旨在通过时间转录组分析结合功能验证，揭示Mpp51Aa毒素在绿盲蝽肠道中的毒性机制，特别是MAPK信号通路及其下游靶点的作用。

**主要技术方法**

研究人员从中国农业科学院植物保护研究所廊坊试验站采集绿盲蝽成虫，在实验室中饲养繁殖，使用次代若虫进行实验。主要关键技术方法包括：1）转录组测序（RNA-seq）：分别以LC₅₀浓度的Mpp51Aa1（11.87 μg/mL）和Mpp51Aa2（61.34 μg/mL）处理2龄若虫，于6、12、24 h取肠道组织进行转录组分析，以磷酸盐缓冲液（PBS）处理为对照。2）RNA干扰（RNAi）：通过微量注射dsRNA（每只若虫50 nL，300 ng）至血腔，沉默靶基因（MAPK成员、ALP、APN等），以dsGFP为阴性对照。3）MAPK化学抑制剂处理：在人工饲料中添加p38抑制剂（SB 203580）、JNK抑制剂（JNK Inhibitor II）和ERK抑制剂（Mirdametinib），处理24 h后再进行毒素暴露。4）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：以肌动蛋白（Actin）和核糖体蛋白L32（RPL32）为内参，检测基因表达变化。5）蛋白质免疫印迹（Western blot）：检测MAPK总蛋白及磷酸化蛋白水平。6）生物信息学分析：利用系统发育分析、保守结构域预测、聚类分析等鉴定候选基因。

**研究结果**

**3.1 绿盲蝽肠道对Mpp51Aa毒素的转录组响应**
通过转录组测序，研究人员发现Mpp51Aa1和Mpp51Aa2均诱导了时间依赖性的转录活性增加，差异表达基因（DEGs）数量在24 h达到峰值。Mpp51Aa1触发的转录响应更强，24 h DEGs达4203个，而Mpp51Aa2为2137个，与Mpp51Aa1更高的毒性效力一致。

**3.2 MAPK通路响应Mpp51Aa毒素的调控**
转录组分析显示，Mpp51Aa毒素上调了特定MAPK成员（如MEKK1、MAPK15/ERK7、p38b等），但整体多数MAPK基因下调。qRT-PCR和Western blot验证表明，Mpp51Aa毒素在转录和蛋白水平上均增加了p38和ERK的表达，但降低了JNK的表达。Mpp51Aa1诱导的响应更强或更早。发育阶段表达谱显示，MAPK基因在2–4龄若虫中表达较高，5龄和成虫中较低。

**3.3 MAPK在毒素敏感性中的功能作用**
通过RNAi沉默p38、JNK和ERK2后，Mpp51Aa1处理组的若虫死亡率降低超过50%；而沉默ERK1无显著效果。对于Mpp51Aa2，沉默p38、JNK和ERK1降低了死亡率，但沉默ERK2无效。化学抑制剂实验进一步证实：p38和ERK抑制剂降低了Mpp51Aa1处理组的死亡率，而JNK抑制剂无效果；对于Mpp51Aa2，三种抑制剂均显著降低死亡率。这些结果表明，p38和ERK的激活促进了毒素诱导的损伤，而非保护作用。

**3.4 肠道中Mpp51Aa响应基因的鉴定**
研究人员从转录组中筛选出11个差异表达的候选受体基因，包括1个ALP、3个APN、4个ABCC和3个ABCG。qRT-PCR显示，ALP和APN（GE061_017673）表现出毒素特异性响应：被Mpp51Aa1下调，被Mpp51Aa2上调。系统发育和结构域分析确认这些候选基因具有典型特征（如肽酶M1结构域、跨膜区等）。发育阶段和组织特异性表达谱显示，这些基因在早期若虫肠道中高表达，与Bt毒素受体的典型表达模式一致。

**3.5 MAPK介导的肠道响应基因反式调控及其功能作用**
通过RNAi沉默MAPK成员后，分析候选基因表达变化：沉默p38下调了ALP2、ABCC1和ABCC4，上调了ABCG4和ABCC2；沉默JNK抑制了APN2和所有ABCC，但诱导了ALP2和APN1；沉默ERK导致大多数基因广泛下调。功能验证表明，仅沉默ALP2显著改变毒素敏感性：Mpp51Aa1处理组死亡率降低约60%，Mpp51Aa2处理组降低约40%。沉默ALP1或APN1–3对死亡率无显著影响，表明ALP2是Mpp51Aa毒素在绿盲蝽中的关键功能介质。

**讨论与结论**

讨论部分指出，Mpp51Aa1和Mpp51Aa2尽管结构高度相似，但引发的转录组响应差异显著，这与其毒性差异直接相关。MAPK通路在绿盲蝽中呈现独特的调控模式：p38和ERK的激活促进而非阻止毒素损伤，这与在其他昆虫中观察到的保护作用相反。JNK被显著下调，且其沉默也降低死亡率，提示JNK的抑制可能是细胞的一种损伤缓解策略或受p38/ERK的拮抗调控。此外，p38和ERK通过反式调控ALP2的表达来增强毒素敏感性，沉默p38和ERK显著降低ALP2表达，进而减少死亡率。ALP2是唯一被验证的功能性敏感性因子，而APN成员未显示直接参与毒性。研究还发现，ABCG和ABCC成员受MAPK通路调控，尤其是ABCC1和ABCC4可能在早期若虫中高表达，是未来功能验证的候选靶点。未检测到钙黏蛋白（cadherin）样转录本响应，提示在半翅目中钙黏蛋白可能不参与Mpp51Aa毒性。

**研究结论**：Mpp51Aa毒素不仅造成直接的肠道损伤，还通过操纵宿主MAPK信号通路来调控关键敏感性因子（如ALP2）的表达，从而促进中毒过程。本研究增进了对半翅目昆虫中Mpp51Aa作用机制的理解，为改进基于Bt的害虫管理策略奠定了基础。该论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。