《Environment International》：Environmental impact of long-term
Bt rice cultivation on soil microbiomes: insights from 15-year field monitoring and interpretable machine learning
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了解转基因作物的长期生态后果对于评估农业集约化下的生态系统稳定性至关重要。在这里，研究人员将15年的连续田间观测与可解释机器学习相结合，研究了苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）水稻种植如何影响土壤细菌群落。在所有样本中，α-多
了解转基因作物的长期生态后果对于评估农业集约化下的生态系统稳定性至关重要。在这里，研究人员将15年的连续田间观测与可解释机器学习相结合，研究了苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）水稻种植如何影响土壤细菌群落。在所有样本中，α-多样性（α-diversity）和β-多样性（β-diversity）指标在Bt和非Bt土壤之间没有显著差异，而时间变化、作物生长阶段（播种前和收获后），特别是土壤深度，成为微生物群落结构的主要驱动因素。使用弹性网络（Elastic Net）模型，研究人员识别了一组微生物分类群（包括ASV1403 Corynebacteriales、ASV4837 Oscillospirales和ASV893 Micrococcales），这些分类群在传统差异分析中表现出极小的丰度差异，但一致地有助于区分Bt和非Bt土壤。这些分类群可能反映了与长期Bt水稻种植相关的微妙但生态相关的变化，尽管它们的功能作用需要进一步验证。总体而言，研究结果表明，相对于更广泛的时间和环境控制，Bt水稻对土壤细菌群落结构的影响有限。通过将长期生态监测与可解释机器学习相结合，本研究为转基因作物的环境风险评估提供了一个数据驱动和透明的框架，并强调了时空变异性在塑造农业管理下土壤微生物组响应中的重要性。一句话总结：长期田间证据表明，Bt水稻对土壤细菌群落影响极小，时间和深度相关因素主导微生物变化。
转基因作物自1996年商业化以来，全球种植面积持续增长，其中Bt水稻（Bacillus thuringiensis水稻，表达杀虫蛋白）因其抗虫性而备受关注，但其对土壤微生物的长期生态影响尚不清楚。以往研究多为短期（2-3年）田间试验，无法捕捉累积效应和微生物群落的渐进变化，且传统统计方法（如差异丰度分析）可能忽略丰度差异微弱但生态相关的微生物动态。因此，本研究旨在通过15年连续田间监测与可解释机器学习（interpretable machine learning）相结合，评估Bt水稻对土壤细菌群落结构的长期影响，揭示其生态安全性与时空变异的主导作用。该研究论文发表在《Environment International》，核心结论表明Bt水稻对土壤细菌群落影响有限，时间和土壤深度是主要驱动因素。
研究人员开展了以下研究：在杭州中国水稻研究所的授权生物安全试验田，自2007年起连续种植Bt水稻（Huahui-1, HH1，表达Cry1Ab/Ac蛋白）和非Bt水稻（Minghui-63, MH63），采用标准农业管理（统一施肥、人工除草、无杀虫剂）。在2008-2021年间多个时间点（播种前BS和收获后AH）采集土壤样本，并在2021年进行分层采样（0-7、7-14、14-20 cm，即顶层、中层、底层）。共181个样本进行16S rRNA基因V4区扩增子测序（Illumina MiSeq平台），经QIIME2和DADA2处理获得5,048个扩增子序列变异（ASV）。通过线性混合模型（LMM/GLMM）分析α-多样性（ASV丰富度、Shannon指数、Chao1指数、Faith系统发育多样性），使用置换多元方差分析（PERMANOVA）评估β-多样性（Bray-Curtis距离），利用limma/voom进行差异丰度分析，并构建四种机器学习模型（随机森林RF、支持向量机SVM、弹性网络EN、朴素贝叶斯NB）进行判别分析，采用累积局部效应（ALE）和部分依赖图（PD）解释模型。
研究结果如下：
**3.1 水稻品种和时间、阶段对微生物群落的影响**：通过线性混合模型，发现α-多样性指标在Bt和非Bt土壤间无显著差异（如ASV丰富度Wald chi-square=1.43, p=0.23），但时间（年份）和生长阶段（BS vs AH）有显著影响。ASV丰富度在HH1中略高，但其他指数无一致差异。PERMANOVA显示品种、时间、阶段均显著影响β-多样性，但品种效应弱（F=12.08, p<0.001），而年份和阶段效应更强，PCoA（主坐标分析）显示样本按年份聚类，品种间高度重叠。
**3.2 水稻土壤微生物组结构与Bt关系微弱**：PERMANOVA表明品种解释的变异较小，PCoA和NMDS（非度量多维尺度分析）显示品种间微生物组成高度重叠，Bt对土壤微生物组结构影响微弱。
**3.3 土壤深度不改变整体微生物α-多样性**：对2021年分层样本分析，α-多样性指标在顶层、中层、底层间无显著差异（如ASV丰富度Wald chi-square=1.90, p=0.39），品种间也无差异。
**3.4 土壤深度塑造微生物β-多样性和分类组成**：PERMANOVA显示深度显著影响群落组成（pseudo F=2.78, p<0.01，解释21.70%变异），品种无显著影响；PCoA显示顶层和底层样品明显分离，且细菌丰度随深度增加而降低。
**3.5 Bt引起的细菌分类丰富度差异**：limma差异分析共鉴定666个ASV在Bt和非Bt间有差异，但多数仅出现在单个年份，仅9个ASV在总体平均中显著（7个减少，2个增加）。相比之下，阶段和深度影响的ASV数量更多，表明环境因素主导。
**3.6 细菌群落可作为区分Bt和非Bt水稻土壤的生物标志物**：四种机器学习模型中，EN模型表现最佳（平均准确率0.66，ROC_AUC 0.67），200次运行中最高准确率0.78。特征重要性显示TOP10预测因子（如ASV1403 Corynebacteriales、ASV4837 Oscillospirales、ASV893 Micrococcales等）在Bt土壤中重要性突出，但这些ASV在limma分析中丰度差异不显著。ALE和PD图揭示这些预测因子与Bt土壤的非线性关联，表明其生态功能超越丰度变化。
总结讨论部分：研究人员指出，Bt水稻对土壤微生物多样性的影响小于时间和阶段，微生物群落主要受环境过滤和时空动态驱动。核心微生物组具有弹性，但某些属（如Blastococcus、Ferritrophicum、GOUTA6）的变化反映功能转变。土壤深度是β-多样性的主要驱动因素，但α-多样性稳定，与氧气、养分梯度相关，但本研究缺乏相应理化参数。可解释机器学习（EN+ALE/PD）识别了丰度不敏感但功能相关的微生物指示物，如Corynebacteriales和Oscillospirales，未来需结合多组学和跨领域研究。翻译研究结论部分：总之，研究人员的长期田间研究表明，与时间、种植阶段和土壤深度等主要驱动因素相比，Bt水稻种植对土壤细菌群落结构的影响极小。15年间稳定的α-多样性和弹性核心微生物组的持续存在表明，Bt水稻在生态系统水平上与可持续农业实践兼容。虽然研究人员的分析集中于细菌群落，但这些分类群在养分周转和土壤生物地球化学中发挥核心作用，因此为评估微生物对长期农业干扰的响应提供了可靠的代理指标。研究结果进一步强调土壤深度是微生物组成的关键调节因子，强调未来研究需要将微生物模式与潜在的理化梯度联系起来。通过将可解释机器学习与长期生态数据相结合，本研究将生物安全评估从描述性比较推进到机制性假设生成。所提供的框架为评估全球农业集约化下转基因作物的生态稳定性提供了一种可扩展和透明的方法。
