鸡败血支原体纯培养物中细菌浓度的新型估算方法

《Applied Microbiology》：A New Method to Estimate Mycoplasma gallisepticum Bacterial Concentration in Culture

　　

快速估算纯培养物中细菌数量是重要的研究工具，常通过测定培养物光密度（Optical Density, OD）实现，但该方法对支原体培养物用途有限。因此，研究人员基于裂解细胞基因组DNA的荧光测定，开发了一种估算鸡败血支原体（Mycoplasma gallisepticum）纯培养物细胞数量的新方法。研究人员利用颜色变化单位（Color Change Units, CCU）或菌落形成单位（Colony Forming Units, CFU）获得的鸡败血支原体实际计数，建立方程，从而依据裂解细胞DNA浓度数据或培养物中支原体光密度数据估算支原体浓度。结果表明，计算所得计数略优于OD600数据所得结果；进一步显示，利用DNA浓度计算培养物浓度较OD600数据具有更宽的可测范围；同一物种内由一株鸡败血支原体建立的方程可适用于另一株鸡败血支原体，但对不同支原体菌种则不准确。这些结果提示，测定裂解支原体细胞的DNA浓度可为估算支原体培养物浓度提供另一种有用工具。

研究背景方面，纯培养物中细菌浓度的准确定量是获得可重复实验结果的关键步骤。传统菌落形成单位（CFU）法依赖固体培养基生长，对部分细菌需特殊培养基且耗时；直接显微计数、流式细胞术及定量实时聚合酶链反应（qPCR）等方法则受设备、死细胞及碎片干扰。支原体为最小自由生活细菌之一，无细胞壁、基因组小，因体积小导致显微与流式检测受限，且在固体培养基生长差异大，故常用颜色变化单位（CCU）替代CFU。支原体生长缓慢，CFU或CCU获结果需数天至数周，实验起始活菌标准化困难；常规光密度（OD₆₀₀）法因支原体散射光弱及培养基含酚红pH指示剂而受限。已有研究提示DNA含量与CCU计数相关，本文据此开发基于裂解细胞释放基因组DNA、荧光计定量的快速估算方法。

主要关键技术方法方面，研究人员使用鸡败血支原体R-low株（Steve Geary赠）、F株（商品活疫苗来源）及鸡支原体（Mycoplasma gallinarum）K5446A株（Stanley Kleven赠），均于Frey肉汤对数期取样；以CCU（96孔板10倍稀释Reed-Muench半数终点法）和CFU（Frey琼脂滴种20-200菌落计数）为真值；DNA组为培养物经PBS洗涤、离心、TE+SDS裂解、Qubit 4荧光计测dsDNA HS浓度并扣除空白背景；OD组加1 M磷酸钠调pH 6.8后用Nanodrop 2000c测OD₆₀₀；统计用Excel散点幂回归与JMP曲线拟合生成预测方程，比较DNA与OD模型准确度。

研究结果部分，在“3. Results”中，研究人员首先展示DNA浓度对CCU呈约三个数量级幂律关系，空白培养基背景约0.181 ng/μL需扣除，校正后低浓度低于0.08 ng/μL时估算失真。对数期样品中，DNA法计算值较实际CCU偏高2.5 log、OD₆₀₀法偏高3.5 log，说明死细胞碎片均影响两法但DNA法偏差更小。独立验证集显示DNA法与OD₆₀₀法计算值均接近实测值，DNA法在低浓度区更准确，OD₆₀₀在DNA约0.3 ng/μL时归零；Pearson相关分析表明CFU任一模型相关性最佳，但CFU数据少，各数据集中DNA浓度模型准确度均优于OD₆₀₀模型。鸡支原体K5446A仅获CFU（不引起pH变色），其DNA法可测范围至少3 log（R²=0.6763）优于OD₆₀₀的2.5 log（R²=0.5275）。同物种内R-low与F株共用方程偏差小，但跨物种套用R-low方程至K5446A时计算值显著偏低，提示同物种株间可通用、跨物种需新建方程。基因组等价数计算显示R-low链短、F株链稍长、K5446A链显著长，解释了跨物种CFU/DNA比差异。

讨论部分，研究人员指出DNA定量估算支原体浓度可行且与既往M. hyopneumoniae研究一致；DNA法较OD₆₀₀更准确、范围更宽，代价为多用约15分钟及荧光计，对倍增时间约120分钟的鸡败血支原体可接受。OD₆₀₀受酚红及培养基黄色干扰，需加磷酸钠调pH至6.8消减；酚红变色仅粗略指示对数/静止期。支原体丝状生长长度株间种间各异，导致CFU低估而DNA反映总细胞基因组数，需逐株标准化。背景DNA源于培养基成分（猪血清、酵母提取物）黏附管壁，限定最低可测浓度。该法为无壁支原体纯培养定制，对大肠杆菌结果不稳，推广至有壁菌需改良。

论文结论翻译：上述结果显示，通过定量DNA含量估算支原体培养物浓度是一种可行方法，与既往比较纯培养物中活支原体计数方法的研究一致，也与Garcia-Morante等关于M. hyopneumoniae生长曲线中DNA含量与qPCR及ATP法吻合的结果一致。DNA含量法与光密度法结果相似，但DNA法准确度更高且检测范围略宽；两法均需标准曲线。OD法快速且设备普及，DNA法多耗约15分钟与荧光计以换取准确度。鸡败血支原体倍增约120分钟，故估算耗时增加不受生长影响，但对快生长菌可能受限。OD法受酚红等色度干扰，600 nm加磷酸钠调pH 6.8可最小化影响。酚红变色仅提示生长相而非定量依据。丝状生长致CFU低估、DNA反映总基因组数，同物种株间方程可通用而跨物种不可。背景DNA来自培养基黏附，限定低浓度下限。本法为无壁支原体纯培养设计，对有壁菌及其他有质粒菌价值有限。该研究发表于《Applied Microbiology》。