宏基因组测序技术在尼日利亚的一组未分化发热症状患者的横断面临床队列中检测到了病毒和细菌

《mSphere》：Metagenomic sequencing detects viruses and bacteria in a cross-sectional clinical cohort of undifferentiated febrile illness in Nigeria

　　

摘要：在传染病负担最高的地区，如西非，基于分子和显微镜的诊断能力往往不足或不可用。快速诊断检测（RDT）可以提供常见感染的快速且负担得起的诊断，但由于检测和处理假阴性及假阳性结果的局限性，这是一种不完美的解决方案。RDT的替代方案是无偏倚宏基因组测序用于病原体监测。在此，研究人员展示了来自无偏倚宏基因组测序的数据，用于识别尼日利亚高原州乔斯市未确诊发热性疾病的病因。该方法的原理验证已由多个研究团队展示，他们识别了流行性和地方性病毒性疾病，如拉沙热、黄热病和基孔肯雅热。研究人员表明，无偏倚深度测序和宏基因组分析可用于识别临床样本中的RNA病毒。研究人员对乔斯市诊所调查中患者（n = 343）的血清RNA进行了测序，其中许多患者为急性发热（76%）。研究人员在39份（11%）标本中检测到五种人类感染性病毒。其中包括乙型肝炎病毒、人pegivirus和几种指环病毒。虽然识别的大多数病毒不太可能引起采样患者的临床症状，但它们的存在证明了研究人员方法的有效性。此外，测序数据使研究人员能够识别来自潜在致病菌的遗传物质，这是发热性疾病的另一种可能病因。重要性：在资源匮乏地区，由感染性病原体引起的发热是疾病的主要来源，但检测和识别这些病原体的工具通常有限。识别样本中所有潜在感染性生物体遗传物质的无偏倚方法代表了发现发热源的机会。宏基因组测序可以改善对资源匮乏环境中病原体景观的洞察，可能提供疾病爆发的早期检测。然而，无偏倚宏基因组测序（mNGS）并非万能药；它容易受到污染和假阳性的影响。研究人员使用mNGS评估了尼日利亚乔斯市超过300名就诊者的血清，其中大多数（>70%）有不明原因发热。研究人员的目的是了解尼日利亚乔斯市虫媒病毒（arbovirus）的流行情况，并识别诊所未常规监测的感染源。研究人员检测到乙型肝炎病毒以及非致病性指环病毒。该研究提供了对mNGS在病原体监测中的实用性和局限性的见解。

在低收入和中等收入国家，未分化发热性疾病（undifferentiated febrile illness）是常见问题，但病毒性病因的检测率极低，如西非地区分子和显微镜诊断能力不足。快速诊断检测（RDT）虽能快速诊断常见感染（如疟疾、伤寒），但存在假阴性/假阳性、交叉反应及无法检测未知病原体等局限。为填补这一空白，研究人员采用无偏倚宏基因组测序（mNGS）对尼日利亚高原州乔斯市四个诊所的未确诊发热患者进行病原体监测，旨在识别虫媒病毒（arbovirus）等非RDT常规检测的感染源，并评估mNGS在资源匮乏环境中的实用性与局限性。该研究发表在《mSphere》。

研究人员开展了以下研究：从2023年6月至10月，在乔斯市四个诊所（Comprehensive Health Centre Dadin Kowa、Faith Alive Foundation、Famoseg、Plateau Specialist Hospital）收集486名患者血清，最终343份样本通过分析。主要技术方法包括：RNA提取（TRIzol LS-氯仿法）、双链cDNA合成（序列非依赖性单引物扩增，SISPA）、纳米孔测序（Oxford Nanopore）及生物信息学分析（NVD流程用于病毒检测，GOTTCHA2和CZ ID用于细菌检测）。样本队列来源注明为尼日利亚高原州乔斯市四个诊所，患者年龄跨度2-75岁，男女比例约1:2，76%为急性发热。

研究结果部分（保留原小标题）：

**Patient population**：通过对486名患者数据的分析，发现患者群体中位年龄28岁，78%出现发热，74%伴有至少一种额外症状（如头痛、关节痛、腹泻等）。样本分布不均，主要来自Faith Alive Foundation（47%）和Famoseg（32%）。

**Sequencing performance**：制备13个测序文库，共512个样本（含对照），最终343份样本保留。测序深度与病毒检测能力强相关（R²=0.97），平均深度1.2M reads/样本，但人类病毒reads仅占8.4%。交叉污染率低（平均0.15%）。

**Viruses**：经严格过滤后，在39/343份样本（11%）中检测到6种病毒：乙型肝炎病毒（HBV，n=2）、人pegivirus（HPgV，n=8）、指环病毒（TTV，n=11）、TTV样微小病毒（n=19）、丁型肝炎病毒（n=2）及Gammotorquevirus属（n=3）。其中TTV样微小病毒最常见（5.5%），HPgV在单个样本中覆盖率达76%基因组。

**Taxon-agnostic analysis results**：通过GOTTCHA2和CZ ID分析，保留53种潜在致病菌，最常见的是Enterobacter kobei（3.5%样本），但覆盖度低（最大20 reads/样本，中位覆盖2500 bp）。细菌数据受诊所批次效应影响（R²=9.9%）。

**Malaria RDT concordance**：对比RDT疟疾诊断与测序结果，发现一致性极差。仅1/21 RDT阳性样本检测到P. falciparum reads，且后续BLAST验证显示这些reads为人类或污染序列，确认无真正的疟原虫信号。这表明mNGS对血清中疟原虫检测无效。

讨论部分总结：研究人员指出样本转运过程中冷链可能中断导致核酸降解，宿主污染（人类reads为主）及实验室污染是主要挑战。尽管检测到HBV和指环病毒等，但细菌信号难以确定是否真正感染。mNGS的敏感性既是优势也是风险，如检测到低水平污染（如西尼罗病毒、登革病毒）需额外验证（如tiled PCR）。研究强调，mNGS在资源有限环境中的常规临床监测仍面临困难，但在聚合监控（如废水）或急性暴发调查中具有价值。

研究结论翻译：本研究的目的是使用mNGS检测并识别尼日利亚高原州乔斯市四个诊所就诊患者中发热性疾病的可能病原体。研究人员能够检测到常见的非致热性人类感染病毒，但仅在少数样本中。细菌性发热源的检测更常见，但覆盖度低，需通过培养或qPCR确认。研究人员认为，在聚合公共卫生监测环境中，长期mNGS监测数据可提供微生物群落基线估计，有助于标记潜在病原体。同时，mNGS在明确定义的患者群体中可缩小疾病暴发病因范围，但若无二次确诊能力，其时间、技术和资源需求可能不适合作为常规临床诊断工具，尤其在资源匮乏情况下。