《Food Bioscience》：Biochemical characterization of a commercial β-glucosidase for the efficient production of the natural sweetener phyllodulcin from
Hydrangea serrata extract
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摘要菲洛杜尔辛是一种从锯叶绣球叶中提取的天然高倍甜味剂，其甜度约为蔗糖的400到800倍。本研究建立了一种高效的生物转化工艺，可将菲洛杜尔辛的糖苷形式——菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷转化为目标物质。在25种商业酶中，Pentopan 500BG因其出色的脱糖活性被选中，其对应的β
摘要
菲洛杜尔辛是一种从锯叶绣球叶中提取的天然高倍甜味剂，其甜度约为蔗糖的400到800倍。本研究建立了一种高效的生物转化工艺，可将菲洛杜尔辛的糖苷形式——菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷转化为目标物质。在25种商业酶中，Pentopan 500BG因其出色的脱糖活性被选中，其对应的β-葡萄糖苷酶（43 kDa）也被纯化并进行了特性分析。该纯化酶在pH 5.5和70°C条件下活性最高，在30–60°C下放置60分钟后仍保持80%以上的活性，而在70°C及以上温度下则会迅速失活。Mn2+的存在显著提升了该酶的催化效率，使其效率提高了1.4倍。值得注意的是，该纯化酶对菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷具有极高的底物特异性，其kcat/Km值（216.68 s-1·mM-1）是其他芳基-β-葡萄糖苷的10到40倍。此外，抗氧化实验（DPPH、ABTS和FRAP）表明，菲洛杜尔辛本身的抗氧化活性远远高于其葡萄糖苷前体。这些结果证明，由Pentopan 500BG衍生的β-葡萄糖苷酶是一种高效生物催化剂，为菲洛杜尔辛的生产提供了巨大潜力。
引言
在现代社会，过量摄入糖分已被认为是导致代谢综合征的主要因素，包括肥胖、糖尿病、心血管疾病和高脂血症等。因此，作为蔗糖替代品的高强度、低热量甜味剂的需求急剧增加（Cheng等人，2026年）。甜味剂通常分为天然和人工两类。天然甜味剂包括糖醇、甜味蛋白和斯蒂维醇糖苷，而人工甜味剂则包括三氯蔗糖、糖精和阿斯巴甜等化合物。然而，有研究指出，人工甜味剂会导致食物奖励途径的激活不完整，并引发肠道微生物群的变化，从而降低葡萄糖耐受性，增加肥胖、心血管疾病及整体死亡风险（Iizuka，2022年）。因此，食品领域中蔗糖和人工甜味剂正逐渐被天然甜味剂取代（Castro-Mu?oz等人，2022年）。在各类天然甜味剂中，斯蒂维醇糖苷和菲洛杜尔辛被视为下一代替代品。目前有许多研究致力于通过酶法生产斯蒂维醇糖苷，比如利用葡萄糖转移酶合成类似雷鲍迪苷D的化合物（Kim等人，2025年），以及通过β-葡萄糖苷酶的生物转化法生产鲁布索苷（Ko等人，2022年）。尽管取得了这些进展，但与其它天然甜味剂相比，针对菲洛杜尔辛的高效酶法生产研究仍然相对较少。
锯叶绣球（Hydrangea macrophylla var. thunbergii）属于绣球花科的落叶灌木，广泛分布于东亚地区，包括韩国、中国、日本和印度尼西亚，通常在6月至7月间开花（J. H. Lee等人，2024年）。锯叶绣球的叶提取物已被认定为GRAS（一般认为安全）物质，在韩国和日本被当作传统草药茶饮用，被称为“Gamrocha”或“Amacha”（Han等人，2022年）。锯叶绣球叶片的极高甜度源于菲洛杜尔辛，这是一种二氢异香豆素衍生物。在新鲜叶片中，菲洛杜尔辛主要以非甜性的菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷形式存在。不过，在内源性的β-葡萄糖苷酶作用下，这种糖苷会水解为菲洛杜尔辛，后者的甜度约为蔗糖的400到800倍（I. H. Kim等人，2003年；M. J. Kim等人，2016年）。值得一提的是，除了极高的甜度之外，菲洛杜尔辛还具有多种生物活性，包括抗氧化、抗过敏、抗溃疡、抗炎和降糖作用（Cho等人，2024年；Jung等人，2016年），因此作为下一代天然替代甜味剂极具价值。所以，通过脱糖反应将菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷转化为菲洛杜尔辛，是实现高效生产这种珍贵甜味剂的关键策略。
为克服这一限制并建立高效的生产体系，利用高效酶制剂进行生物转化是一种极具前景的方法。生物转化指的是借助生物体或分离出的酶对目标化合物进行特异性化学转化的过程（De Sousa等人，2018年）。利用这些生物催化剂的底物特异性，可以通过结构改造显著提升活性成分的含量和生物利用率，从而为从自然资源中开发高附加值产品提供有效途径（B.-H. Kim等人，2019年；Valentová，2023年）。虽然β-葡萄糖苷酶、右旋糖转糖酶、纤维素酶（H. N. Lee等人，2021年）和葡萄糖转移酶（H. J. Kim等人，2025年）等单一酶类经常被使用，但商业酶制剂的工业应用正日益普及。由于大多数商业酶产品都是具有多种催化活性的复杂蛋白质混合物（Cosme等人，2023年），使用这类粗制酶制剂而非单独纯化的酶，往往能更高效、更经济地筛选和发现新的生物催化剂（Van Dyk & Pletschke，2012年）。事实上，这种基于商业酶的策略已在多个领域得到成功应用，比如从人参皂苷Rb1中高效生产化合物K（S. Y. Kim等人，2022年）、从桦褐孔菌中更有效地提取多酚（S. Bin Kim等人，2022年），以及降解食品中的霉菌毒素（Loi等人，2017年）。
因此，本研究旨在利用商业酶复合物建立一种高效的生物转化工艺，将菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷转化为菲洛杜尔辛。首先对具有菲洛杜尔辛转化活性的商业酶进行了纯化处理，然后系统分析了其生化特性、底物特异性和动力学参数。此外，还对比评估了菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷和菲洛杜尔辛的抗氧化活性，以此揭示其苷元形式的更高功能价值。
章节节选
材料与酶
溶剂为高效液相色谱级的水和乙腈，均购自韩国首尔的Duksan General Science Co., Ltd.。水杨苷、麦芽糖、龙胆二糖和纤维二糖来自美国密苏里州圣路易斯的Sigma Chemical Co.，熊果苷则购自日本东京的TCI公司。蔗糖和乳糖则来自加拿大安大略省马卡姆的Bio Basic公司。本研究所使用的锯叶绣球种植于韩国全罗南道咸平郡。
筛选可用于转化菲洛杜尔辛的商业酶
为了找到能够将菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷转化为菲洛杜尔辛的酶，我们首先使用了25种商业酶进行了初步筛选（见表1）。每种酶都与3 mM浓度的菲洛杜尔辛-8-O-葡萄糖苷反应30分钟，随后通过薄层色谱法分析反应混合物。酶的选择及制备流程如图1中的流程图所示。虽然大多数商业酶没有表现出可检测的β-葡萄糖苷酶活性，但有四种酶（Pentopan 500BG、Ultraflo L、Viscozyme L和Cellulase Onozuka R-10）成功实现了转化。
结论
本研究成功从商业酶制剂Pentopan 500BG中鉴定出一种β-葡萄糖苷酶，并对其进行了生化特性分析，证实它是一种用于生产菲洛杜尔辛的高效生物催化剂。纯化后的PBG具备良好的工业应用前景，不仅在较宽的pH范围内保持稳定，而且在10 mM Mn2+存在的情况下仍具有强大的催化活性。尤其值得关注的是，PBG表现出极高的底物特异性，以及最高的催化效率。
CRediT作者贡献说明
Young-Min Kim：撰写——审阅与编辑、指导、概念构思。 Min-Hyeong Kim：撰写——初稿、方法学、实验研究。 Seong-Jin Hong：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、方法学。 Jeong-Yong Cho：撰写——审阅与编辑、指导。 Hye-Jin Kang：实验研究。 Ye-Seon Won：方法学、实验研究。
未引用参考文献
Amer等人，2017年；Rice-Evans等人，1997年；Kim等人，2022年；Kim等人，2022年；Yoshkawa等人，1999年。
利益冲突声明
本研究的开展与报告均未受到任何财务或个人利益冲突的影响。
利益冲突声明
? 作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益冲突或个人关系。
致谢
资助支持：本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金由韩国科学信息通信技术部提供支持；同时还获得了韩国农业、食品和农村事务部通过高附加值食品技术发展计划资助的韩国食品、农业和林业技术规划评估院的经费支持（项目编号分别为RS-2026-25475452和RS-2024-00403067）。
Min-Hyeong Kim|Ye-Seon Won|Hye-Jin Kang|Jeong-Yong Cho|Seong-Jin Hong|Young-Min Kim
韩国光州全南国立大学研究生院综合食品、生物科学与生物技术系，邮编61186
