山羊和牛酪乳中富含乳脂球膜成分的蛋白质组学与脂质组学比较

《Food Chemistry》：Proteomic and lipidomic comparisons of milk fat globule membrane (MFGM) enriched ingredients from caprine and bovine buttermilk

　　

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  牛源MFGMi含有更多的黏蛋白XO、PC以及DPA/EPA-PLs。
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  山羊源MFGMi富含宿主防御蛋白以及ARA/DHA-PLs。
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  山羊源MFGMi中含有更多GD3(d38:1)和GD3(d40:1)。
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  Perilipin-2和PE(P-18:0/18:2)是其特征性生物标志物。

引言

牛奶脂肪球膜是存在于牛奶中脂肪滴周围的三层结构，主要由生物活性蛋白和极性脂质构成。这些生物活性蛋白包括丁酪磷蛋白、黄嘌呤氧化酶、乳粘附蛋白以及黏蛋白。而主要的极性脂质则包括甘油磷脂，比如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱，以及鞘脂，例如鞘磷脂和神经节苷脂（Holzmüller & Kulozik, 2016）。

市面上的富MFGM成分通常含有6–8%的极性脂质、超过65%的蛋白质（主要为乳清蛋白）、10–16%的中性脂质，乳糖含量则低于8%（Raza, Herzig, & Lepp?luoto, 2021）。这类成分一般通过以下步骤从奶酪乳清中制备：首先通过离心去除残留的脂肪球，再通过超滤去除乳糖和盐分，接着通过微滤去除低分子量的乳清蛋白，最后通过蒸发浓缩MFGM成分。此外，也可通过奶油作为原料，先通过离心使脂肪含量达到70%（重量比）以上，再通过热辅助相变处理获得β-血清，随后通过膜过滤和蒸发处理得到富MFGM的浓缩物（Raza et al., 2021）。不过这两种制备过程都涉及多次加热处理，可能会导致MFGM中的生物活性蛋白发生变性或活性下降（Xiong, Li, Boeren, Vervoort, & Hettinga, 2020）。另一种可能的制备方法是搅拌含约40%脂肪（重量比）的牛奶奶油，得到酸乳，其成分与脱脂牛奶相似，但含有的MFGM片段更多（Rombaut, Camp, & Dewettinck, 2006）。接下来的步骤是通过凝乳酶凝固、酸沉淀，或是借助酪蛋白水解或钙螯合的膜分离技术去除酪蛋白。研究表明，与酸沉淀法相比，使用凝乳酶凝固酸乳能保留更多的MFGM成分，尤其是极性脂质（Sachdeva & Buchheim, 1997; Song et al., 2024）。而通过水解或螯合辅助的膜分离方法则会导致大量MFGM成分流失到渗透液中（Konrad, Kleinschmidt, & Lorenz, 2013; Rombaut et al., 2006）。由酸乳制成的凝乳酶乳清是一种很有潜力的中间产物，后续可通过膜过滤和蒸发处理来制备MFGMi。

MFGMi在食品领域有着多种功能应用，可作为人造黄油中的天然乳化剂、药物递送系统的包封壁材料、酸奶的持水能力调节剂，以及婴儿配方奶粉的营养强化剂（Ji, Cronin, Fitzpatrick, & Miao, 2017; Nie et al., 2024; Ribeiro et al., 2015）。目前中国等国家对在以山羊奶为基底的婴儿配方奶粉中添加牛源MFGMi有限制，这就需要开发山羊源MFGMi。MFGMi的生物活性与其特定的成分组成密切相关，尤其是那些含量较低但活性较高的成分。诸如黏蛋白、乳粘附蛋白和黄嘌呤氧化酶这类生物活性蛋白在多种生理功能中发挥着重要作用：黏蛋白作为一种粘附蛋白，能够保护新生儿的消化道免受微生物和酶的侵害（Smoczyński, Staniewski, & Kie?czewska, 2012）；乳粘附蛋白可以结合病原体并调节免疫反应，具备抗菌和抗炎作用（Smoczyński et al., 2012）；黄嘌呤氧化酶则参与多种代谢过程，还具有抗病毒特性（Harrison, 2006）。另一方面，极性脂质对促进神经认知发育也至关重要（Wilmot, Miller, Patil, Kelly, & Jimenez-Flores, 2025）。正是这些生物活性成分，使得MFGMi在婴儿配方奶粉及功能性食品中具有重要的应用价值。

MFGMi的成分受多种因素影响，包括乳品来源和加工条件。Brink等人（2020）发现，与奶酪乳清相比，从牛源β-血清中提取的MFGMi含有更高的PL含量，而神经酰胺含量则更低。Han、Zhang和Zhou（2022）的研究表明，原始牛乳中的MFGM所含的黄嘌呤氧化酶和脂肪酸结合蛋白比原始山羊乳中的更多。先前的研究也显示，酸乳相比其他中间产物，如酸乳乳清或奶酪乳清酸乳，含有更多的PL和MFGM蛋白（Song, Liu et al., 2024; Song, Lu, et al., 2024）。Sachdeva和Buchheim（1997）研究了凝乳酶凝固后酸乳中总PL含量的变化。不过，目前关于从酸乳中提取的最终MFGMi的成分研究还比较有限，尤其是以山羊奶为原料的情况。不同物种的MFGM成分在多步骤加工过程中丢失的程度也有所不同。在分离脂肪球的过程中，由于山羊奶的脂肪球尺寸更小，其PL的回收率低于牛乳（Lamothe, Robitaille, St-Gelais, & Britten, 2008）。在搅拌奶油的过程中，山羊奶中较小的脂肪球由于拉普拉斯压力较高，更难以被破坏，这可能会改变酸乳中的极性脂质组成（Rombaut et al., 2006）。在酸乳的凝乳酶凝固过程中，MFGM片段可能会被牛源酪蛋白微粒形成的较致密的酪蛋白凝块包裹而大量丢失。此外，不同物种的MFGM蛋白热稳定性存在差异，这也可能影响最终产品的蛋白组成（Zhang et al., 2016）。不过，目前针对不同物种的MFGMi的比较研究仍然较少，这限制了人们对它们营养价值和生物活性的了解。MFGM包含多种蛋白和极性脂质，且它们的含量各不相同，这使得对其识别和定量变得十分复杂。传统的分析方法很难检测到含量较低的MFGM蛋白，也无法区分含量较低的极性脂质，如血浆脂质基因组中的各种脂质类型。而高分辨率蛋白质组学和四维脂质组学则具备足够的灵敏度和特异性，能够全面分析MFGMi的成分，并识别出具有物种特异性的成分。不过，目前关于识别可用于区分不同物种MFGMi的代表性成分的研究仍然不够充分。

本研究从山羊奶和牛奶酸乳中制备了MFGMi，并利用基于数据依赖采集的无标记蛋白质组学技术和四维脂质组学技术分析了它们的蛋白质组学和脂质组学特征。同时，本研究还试图识别出可作为区分牛源和山羊源MFGMi的生物标志物的特征性蛋白和脂质种类。这项研究为原料的真伪鉴定、质量控制以及MFGMi的开发提供了科学依据。

章节要点

材料

用于实验的荷斯坦奶牛的原始牛奶购自中国江苏省无锡市的天泽乳业有限公司。而山羊的原始萨能奶则来自中国浙江省杭州市云泉悦畜牧场。凝乳酶则购自丹麦霍什霍尔姆市的Chr. Hansen Holding A/S公司，产品名为CHY-MAX? Powder Extra NB。Amplex红色染料、辣根过氧化物酶、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺以及次黄嘌呤则购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Co. LLC公司。鞘磷脂

山羊源和牛源MFGMi的成分

如表S1和图S2所示，山羊源和牛源MFGMi的总蛋白、脂质、PL含量以及高分子量蛋白的比例都较为接近。不过牛源MFGMi的黄嘌呤氧化酶活性明显高于山羊源MFGMi，这一差异可能与原始牛乳本身就具有较高的黄嘌呤氧化酶活性有关（Zou et al., 2021）。此外，牛源MFGMi中的神经节苷脂含量也显著高于山羊源MFGMi，这一差异在独立样本t检验中的显著性水平为P<0.05。

结论

通过这项多组学研究，共分析了山羊源和牛源MFGMi中的939种差异蛋白和258种差异脂质。山羊源MFGMi中含有更多的宿主防御蛋白，包括阳离子肽、急性期蛋白SAA3、病原体识别蛋白RNA酶、溶菌酶和乳过氧化物酶，以及维生素和铁吸收相关的蛋白，如TCN-2、铁蛋白、转铁蛋白和乳铁蛋白。而牛源MFGMi中则含有更多的MUC1、MUC15和黄嘌呤氧化酶。KEGG分析显示，补体和凝血级联反应在二者中都起着重要作用

CRediT作者贡献说明

宋波：撰写原文初稿、软件使用、方法设计、实验实施、概念构思。 尹文竹：正式数据分析。 刘大松：文章审阅与编辑、项目监督、资金筹集、数据整理。 陶秀梅：实验实施。 王一淼：资源提供。 张丽娜：软件使用。 Thom Huppertz：文章审阅与编辑。 Joe M. Regenstein：文章审阅与编辑。 刘晓明：资源提供。 周鹏：项目监督、资金筹集。

利益冲突声明

所有作者均声明，不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关联关系。

致谢

本研究部分得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFF1103403）、中央高校基本科研业务费（项目编号：JUSRP202416004）以及中国国家外国专家项目（项目编号：H20240211）的支持。

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