位置和栖息地特异性构建温带海草生态系统底栖微生物群落

《mSphere》：Location and habitat specificity structure benthic microbial assemblages in a temperate seagrass ecosystem

　　

摘要
海草草甸是全球分布的沿海生态系统，为多样物种提供栖息地并促进生态系统服务，如碳储存和营养循环。然而，人类活动和气候变化正导致全球海草衰退，广泛影响生态系统功能。尽管海草栖息地中的大型底栖动物群落相对研究充分，但底栖微生物群落（包括原生生物和微生物后生动物等微真核生物类群）仍未被充分探索。在本研究中，研究人员使用环境DNA（eDNA）宏条形码技术，描述了美国加利福尼亚州Bodega Harbor沿河口梯度三个地点海草田和裸沉积物栖息地中细菌/古菌（16S rRNA 基因）、微真核生物（从原始沉积物扩增的18S rRNA）以及小型底栖动物（从过筛和Ludox处理后的沉积物组分扩增的18S rRNA）的群落组成。研究人员发现，微生物和微真核生物群落主要由位置决定，沉积物性质（砂粒与粉砂/黏粒比例）是群落组装的主要驱动力。栖息地类型是影响底栖动物群落的次要因素，裸沉积物通常比海草床显示出更高的生物多样性，但Westside Park泥滩除外，该处裸沉积物的多样性显著低于所有其他采样地点。线虫生物指示物类群（包括Terschellingia、Daptonema、Viscosia、Microlaimus和Spilophorella）的差异性恢复表明，物理干扰、污染或氧气动态等非生物因素可能影响特定地点特定类群的成功。最后，线虫-细菌共现网络确认了已知的共生关联，并提示了未来研究中值得探索的其他分类学关系。研究人员的发现强调了环境梯度和微生境特征在塑造温带海草生态系统底栖生物多样性中的重要性。
重要性：海草草甸维持着广泛的动植物生命，是至关重要的沿海栖息地。这些水下生态系统支持生物多样性、海岸保护、生物地球化学循环和碳储存。然而，由于气候变化和人类活动的压力，全球海草栖息地正在衰退。本研究描述了美国加利福尼亚州Bodega Harbor温带海草草甸及其周围栖息和环绕的微生物和微真核生物群落（包括体长<1 mm的微生物动物）。研究人员的发现表明，位置是决定每个地点沉积物中微生物群落的主要因素，栖息地类型（裸沉积物与海草床）对微生物物种的生物多样性和分布施加次要影响。通过使用线虫生物指示物类群和线虫-细菌共现模式，研究结果还提示了塑造沉积物生物多样性的特定环境因素，包括潮汐周期、氧气、硫和腐烂有机质。全面了解与海草栖息地相关的底栖群落变化，可以显著增强海草草甸的保护和恢复工作。

论文解读

**研究背景**
海草草甸是分布于全球浅海沿岸的生态系统，覆盖面积约277,000 km2，提供碳储存、沉积物稳定、海岸保护等关键生态服务，并作为鱼类、甲壳类和软体动物等经济物种的育幼场。然而，人类活动（如航运、污染）和气候变化（如海平面上升、温度升高）导致全球海草衰退，尤其在温带低流入河口的潮间带。尽管大型底栖动物（如多毛类、甲壳类）在潮间带海草栖息地中的研究相对充分，但底栖微生物群落（包括原核生物和微真核生物，如原生生物、线虫等小型后生动物）仍未被充分探索。现有研究多局限于大型植物本身或大型动物，对微生物-海草互作、微生境结构及物种共现模式的认识严重不足。环境DNA（eDNA）宏条形码技术为揭示海草生态系统中细菌/古菌和微真核生物的空间分布与互作提供了新途径。

**研究目的**
本研究旨在通过16S rRNA和18S rRNA基因的eDNA宏条形码，系统表征美国加利福尼亚州Bodega Harbor温带海草栖息地中细菌/古菌、微真核生物（包括原生生物和小型底栖动物）的群落，评估位置（沿河口梯度）和微生境（海草床 vs. 裸沉积物）对群落构建的相对重要性，并利用线虫生物指示物和细菌-线虫共现网络探索潜在共生关系。

**主要结论**
研究发现，微生物和微真核生物群落主要由位置驱动，沉积物性质（砂粒 vs. 粉砂/黏粒比例）是主要环境过滤因子，栖息地类型（海草床 vs. 裸沉积物）是次要因素。裸沉积物通常比海草床具有更高的α多样性，但Westside Park泥滩的裸沉积物显示出显著较低的多样性，这与其高砂含量、低有机碳和硫酸盐以及更强的潮汐暴露相关。线虫生物指示物（如Terschellingia、Microlaimus、Daptonema）在不同地点表现出对环境压力（物理扰动、缺氧、污染）的差异性响应。共现分析揭示了线虫与硫氧化细菌、甲烷氧化细菌等潜在共生关系，尤其是在Westside Park裸沉积物中检测到已知携带化能合成细菌的线虫属（Astomonema、Eubostrichus、Robbea）。研究强调了环境梯度和微生境细节在塑造温带海草生态系统底栖生物多样性中的关键作用，并表明潮间带泥滩可能是动物-细菌共生关系的热点。

**论文发表**
该论文发表在《mSphere》（American Society for Microbiology旗下期刊）。

**主要关键技术方法**
1. **环境DNA宏条形码**：利用16S rRNA基因V4区（细菌/古菌）和18S rRNA基因V1-V2区（微真核生物，包括小型底栖动物）进行PCR扩增，在Illumina MiSeq平台双端测序。
2. **样品处理与分类**：沉积物样品分为原始沉积物（0.25 g）和经Ludox浮选（比重1.15）处理的小型底栖动物组分，分别提取DNA。
3. **生物信息学分析**：使用DADA2进行ASV（扩增子序列变体）去噪和推断；基于SILVA 138数据库（16S）和自定义MeioDB数据库（18S）进行分类注释；利用decontam去除潜在污染物。
4. **群落统计与功能预测**：计算α多样性（观测、Shannon、Simpson、Pielou均匀度）和β多样性（Bray-Curtis距离、PCoA、PERMANOVA）；使用ALDEx2进行差异丰度分析；PICRUSt2预测16S基因功能，重点关注硫代谢通路。
5. **共现网络分析**：基于Spearman相关系数（r ≥ |0.4|, FDR校正P < 0.05）构建细菌（16S）与线虫属（18S Ludox）的正相关网络，使用Gephi可视化。
6. **样本队列来源**：样品于2018年7月7日采集自美国加利福尼亚州Bodega Harbor的3个地点：Campbell Cove（外河口）、Westside Park（中河口）、Mason’s Marina（内河口），每个地点分别采集海草床和裸沉积物（各4个岩芯，10×10 cm PVC岩芯）。

**研究结果**

**Bodega Harbor的环境特征**
主成分分析（PCA）显示，内河口Mason’s Marina具有高总有机碳（TOC）、粉砂%和黏粒%，尤其在海草栖息地；中河口Westside Park和外河口Campbell Cove以高砂%为特征。Westside Park裸沉积物砂%最高，TOC、硫酸盐最低。PC1和PC2共同解释99.06%的变异。所有环境变量在站点间、栖息地间及站点内栖息地间均存在显著差异（P < 0.05）。

**微生物和微真核生物群落的α和β多样性模式**
对于微生物（16S），海草与裸沉积物间α多样性无显著差异，但Westside Park海草均匀度显著更高，Mason’s Marina裸沉积物均匀度显著更高。对于微真核生物（18S原始沉积物），Campbell Cove和Westside Park裸沉积物观测多样性显著高于海草，Campbell Cove裸沉积物Shannon和Simpson多样性显著更高。对于小型底栖动物（18S Ludox），三个地点裸沉积物观测多样性均高于海草；Westside Park海草Shannon、Simpson和均匀度显著更高，Mason’s Marina海草Shannon和Simpson显著更低。总体，Campbell Cove α多样性高于Mason’s Marina。β多样性分析（PCoA）表明，微生物和微真核生物群落主要按站点分离，小型底栖动物群落重叠较多，但Westside Park裸沉积物在所有数据集中均与其他样品显著分离。PERMANOVA确认站点和栖息地间差异显著。

**微生物群落的分类组成、差异丰度及预测基因功能（16S rRNA数据集）**
微生物群落主要由Desulfobulbales目（尤其Campbell Cove）和Desulfobacterales、Campylobacterales组成。Westside Park裸沉积物中Pirellulales、Rhodobacterales和Rhizobiales更丰富。差异丰度分析（ALDEx2）显示，Westside Park裸沉积物富集氮循环细菌（Nitrospiraceae、Nitrosococcaceae、Nitrosomonadaceae、Nitrosopumilaceae）和甲烷循环细菌（Methylophagaceae、Methylomonadaceae、Methyloligellaceae），而硫循环细菌（Desulfobacteraceae、Thiotrichaceae、Desulfatiglandaceae）显著贫乏。PICRUSt2预测功能分析发现，除Westside Park裸沉积物外，所有样品中异化硫酸盐还原（DSR）通路（包括硫代硫酸盐还原酶、腺苷酰硫酸还原酶、异化亚硫酸盐还原酶）富集。Westside Park裸沉积物中糖胺聚糖降解通路更丰富，且二甲基硫:细胞色素c₂还原酶（硫代谢关键酶）持续升高。

**主要微真核生物和小型底栖动物类群（18S rRNA原始沉积物和Ludox）**
18S原始沉积物中后生动物占优势，但寄生原生生物Eugregarinorida在裸沉积物中更丰富，硅藻Bacillariophyceae在裸沉积物中常见，甲藻Suessiaceae在内河口Mason’s Marina丰富，寄生原生生物Maullinia（Phytomyxea）在海草栖息地（尤其Campbell Cove）更常见。18S Ludox数据集中后生动物占优势，甲藻Gonyaulacales广泛分布（除Westside Park），子囊菌Dikarya主要在海草栖息地。

**线虫群落的分类组成**
18S Ludox数据集中共恢复772个线虫ASV，对应92属44科。最丰富的科为Linhomoeidae、Chromadoridae、Oncholaimidae。最丰富的属为Ptycholaimellus、Terschellingia、Viscosia。Viscosia、Calyptronema和Enoplida在Westside Park裸沉积物中丰度高。Daptonema和Metalinhomoeus在Campbell Cove和Westside Park海草中更丰富。差异丰度分析显示，Campbell Cove富集Achromadora、Metalinhomoeus、Terschellingia、Ptycholaimellus；Westside Park裸沉积物富集Anticoma、Enoplida、Viscosia，海草富集Acanthonchus、Paramonhystera、Daptonema；Mason’s Marina富集未知Monhysteridae、Microlaimus、Spilophorella。在Westside Park裸沉积物中检测到7个已知携带化能合成细菌线虫的ASV（Astomonema、Eubostrichus、Robbea）。

**细菌/古菌与线虫的共现网络**
共现网络（Spearman r ≥ |0.4|, P < 0.05）包含230个节点和768条边，其中正相关子网络203个节点434条边。网络平均度4.276，模块度0.462，表明存在明确共现模块。线虫Enoplida（92条连接）、Viscosia（64）、Astomonema（37）、Terschellingia（36）、Ptycholaimellus（26）与多种细菌类群正相关。细菌类群Flavobacteriales（33条连接）、Rhizobiales（21）、Cellvibrionales（18）、Bacteroidales（17）、Desulfobacterales（17）连接数最高。Viscosia、Astomonema与Microbulbifer（Cellvibrionales）和PAUC26f（Acidobacteriota）共享共现关系。Microlaimus和Spilophorella与Thiogranum（Ectothiorhodospirales）共现。Diplolaimelloides（仅海草栖息地）与Campylobacterales（硫氧化属Sulfurimonas、Sulfurovum）和Oceanospirillales共现。

**讨论与结论**
讨论部分总结：位置和底栖环境决定群落组装，Bodega Harbor呈现从外河口（砂质、低TOC）到内河口（粉砂/黏质、高TOC）的环境梯度，沉积物粒度和有机质是主要驱动因子，微生物和微真核生物群落主要响应较大尺度梯度，而小型底栖动物群落受微生境影响更明显。Westside Park裸沉积物（泥滩）因高潮汐暴露、低有机质、强物理扰动，成为最独特的底栖群落，富集氮/甲烷循环细菌和大型捕食性线虫（Viscosia、Enoplida），贫化硫循环细菌。线虫生物指示物（如Terschellingia对物理扰动敏感、Microlaimus对污染耐受）支持了不同地点环境压力差异。共现网络揭示了线虫与硫氧化细菌、海草相关细菌的潜在共生关系，并指出潮间带泥滩可能是化能合成共生关系的热点。

**研究结论**
研究人员的发现强调了环境梯度和微生境特征在塑造温带海草生态系统底栖生物多样性中的重要性。位置是决定微生物群落的主要因素，而栖息地类型（裸沉积物 vs. 海草床）是次要驱动因素。通过线虫生物指示物类群和共现模式，研究结果提示了潮汐周期、氧气、硫和腐烂有机质等特定环境因素塑造沉积物生物多样性。全面了解海草栖息地相关底栖群落的变化，可以显著增强海草草甸的保护和恢复工作。