针对虾类酚氧化酶的定向抑制：通过结构分析、酶动力学研究及实际应用发现潜在的抗黑色素沉着化合物

《Food Bioscience》：Targeted inhibition of shrimp phenoloxidase: Discovery of potential anti-melanosis compounds through structural, enzyme kinetics, and practical application

　　

摘要：

虾在冷藏过程中极易出现黑色素沉着现象，这一问题阻碍了虾类产业的发展。酚氧化酶是导致虾黑色素沉着的关键酶，但该酶的提取与纯化十分困难，且开发高效的酚氧化酶抑制剂也面临诸多挑战。本研究从四种对虾的基因组中鉴定出四种酚氧化酶，并将其异源表达。根据序列保守性，选择了具有最高比活性的日本对虾酚氧化酶（PO1）。该酶在35℃、pH 6.0条件下活性最佳，在25–55℃、pH 6.0–9.0范围内稳定性良好，对L-DOPA具有较高的催化活性，还能在低浓度铜离子作用下被激活。通过虚拟筛选和PO1抑制实验，从三个绿色安全的中小分子数据库中筛选出了五种具有抗虾黑色素沉着活性的新型PO1抑制剂。实验结果表明，5-氨基乙酰丙酸盐酸盐和反式-10-羟基-2-癸烯酸能够显著抑制虾的黑色素沉着。抑制动力学和光谱分析显示，这两种物质属于可逆混合抑制剂，会引发PO1结构变化。它们能显著降低虾的黑色素沉着面积、黑色素及多巴胺含量以及黑色素沉着程度，同时改善虾的整体颜色。本研究为开发潜在的抗黑色素沉着剂提供了理论依据和候选分子。

引言

全球范围内，以对虾为主的虾类产品的生产和交易规模都相当可观。根据联合国粮农组织2024年的《世界渔业和水产养殖状况报告》，2022年虾类是交易量第二大的水产品（占比17%），其中凡纳滨对虾的交易量最高，达到680万吨（粮农组织，2024年）。然而，在捕捞后的储存和加工过程中，虾由于微生物和酶的作用，很容易出现黑色素沉着现象（彭等人，2022年）。虾黑色素沉着过程中产生的色素会降低虾的感官品质和市场价值，从而造成巨大的经济损失，也限制了虾类产品的高值利用和工业化加工（林等人，2025年；马丁内斯-阿尔瓦雷斯等人，2008年）。因此，预防虾的黑色素沉着一直是水产品加工业研究的重点。酚氧化酶被认为是导致虾黑色素沉着的主要原因（萨伊-勒奥等人，2018年）。酚氧化酶属于典型的3型铜蛋白，在细菌、真菌、植物和哺乳动物中都有广泛存在（坎帕齐卡斯等人，2020年；麦克拉林和梁，2020年）。它兼具单酚氧化酶和双酚氧化酶的活性。虾体内的酚氧化酶会催化单酚的邻位羟基化反应，以及邻二酚氧化为邻醌，进而引发黑色素沉着（林等人，2022年；萨伊-勒奥和本贾库尔，2019年）。这些邻醌随后会经过一系列非酶促聚合反应形成黑色素（徐等人，2020年）。

为避免虾出现黑色素沉着问题，多年来人们已经开发出了多种抗黑色素沉着技术（彭等人，2022年）。控制虾黑色素沉着的策略主要集中在物理、化学和生物方法上，通过去除氧气、铜离子、底物甚至酶本身等关键反应成分来抑制酚氧化酶的活性（卡尔沃等人，2021年）。其中，低温保存因其安全性和便捷性，长期以来被用于预防虾的黑色素沉着；不过这种方法并非完全有效，还可能引发虾肌肉组织的不良物理和化学变化，同时改变虾的关键感官特性（于等人，2023年）。其他物理抑制技术，如高压处理（戈麦斯-埃斯塔卡等人，2016年）和气调包装（金布阿通等人，2020年），则存在操作复杂、成本高昂的缺陷，目前大多仍处于研究阶段，尚未实现工业化应用（于等人，2023年）。

目前，抑制虾黑色素沉着的主要方法仍然是使用特定的黑色素沉着抑制剂。其中，亚硫酸盐由于其出色的抑制效果和易用性，被全球广泛用作主要的黑色素沉着抑制剂（马丁内斯-阿尔瓦雷斯等人，2008年）。不过，亚硫酸盐会引发过敏反应和哮喘，这限制了它的进一步应用（冈尼森和雅各布森，1987年）。此外，亚硫酸盐处理容易残留过量的二氧化硫，这对人体健康有害。4-己基间苯二酚曾被视为亚硫酸盐的安全替代品，但由于它会导致虾的感官品质下降，也被限制了使用（贡萨尔维斯和梅内塞斯·德奥利维拉，2016年）。因此，目前预防虾黑色素沉着的研究主要致力于通过化学合成或从植物提取物等天然来源中筛选具有抗黑色素沉着特性的更安全替代品。天然食品衍生的化合物作为安全的食品保鲜功能成分，越来越受到重视（刘等人，2026年）。一些新的羟基吡啶酮衍生物（邵等人，2019年）、马齿苋提取物（卡尔沃等人，2021年）、儿茶素及其衍生物（萨伊-勒奥等人，2017年）、樟叶提取物（谢赫等人，2019年）以及泰国本土树叶提取物（艾哈迈德等人，2023年）都被证明可以延缓虾的黑色素沉着（萨伊-勒奥和本贾库尔，2019年）。然而，筛选和鉴定这类抑制剂的流程十分复杂，再加上植物提取物的抑制效果不尽理想，这些都给它们的实际应用带来了很大挑战（于等人，2024年）。

为克服传统抗黑色素沉着剂实验筛选耗时、费力且成本高的问题，虚拟筛选作为一种高效的辅助策略应运而生，能够帮助快速筛选出有潜力的候选物质（安等人，2026年）。通过计算机模拟预测目标蛋白与大型化学库中的化合物之间的结合相互作用，虚拟筛选可以大幅减少需要通过实验验证的化合物数量，从而提高筛选效率，降低研究成本（何等人，2026年）。这种方法已在多个领域的酶抑制剂发现中得到成功应用，展现出极高的实用价值（基尔奇曼等人，2016年；毛等人，2023年）。由于虾的黑色素沉着主要与酚氧化酶的活性相关，基于酚氧化酶结构的虚拟筛选为识别潜在的酚氧化酶抑制剂提供了一种合理且高效的方法。因此，利用虚拟筛选来寻找能够抑制酚氧化酶的化合物，有望帮助开发出有效的虾类黑色素沉着防治剂。

本研究基于四种常见对虾的全基因组信息对酚氧化酶进行了筛选，同时运用虚拟筛选技术从高通量中小分子化合物库中针对性地筛选酚氧化酶抑制剂。此外，还通过抑制动力学和光谱分析方法共同探讨了这些抑制剂的抑制机制。研究还从颜色、黑色素沉着面积、黑色素含量等多个维度，评估了这些抑制剂在虾冷藏过程中的抗黑色素沉着效果。综上，本研究旨在发现并验证潜在的酚氧化酶抑制剂，同时初步探索其抑制机制。

章节节选

质粒、菌株及材料

重组蛋白是通过pET-28a(+)质粒构建的。北京天根公司提供了用于亚克隆的大肠杆菌DH5α菌株以及用于蛋白质表达的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。其他化学品和试剂均为分析级，从商业渠道购买。

基因筛选与序列分析

本研究使用了日本对虾（GenBank编号：GCA_017312705.1）、中国对虾（GenBank编号：GCA_019202785.2）、凡纳滨对虾（GenBank编号：GCA_042767895）以及斑节对虾的基因组全序列信息。

基因筛选与序列分析

检索常见的保守结构域是获取具有相似功能的蛋白质的有效方法。在本研究中，研究人员使用HMMER和Blast算法，从四种高产对虾物种的基因组中筛选含有酪氨酸酶结构域的同源蛋白序列，以此识别酚氧化酶。最终共保留了99条蛋白序列，其中9条被鉴定为酚氧化酶，89条为血蓝蛋白，1条尚未确定功能。

结论

本研究从四种对虾的基因组中筛选出了酚氧化酶，并将其中四种异源表达出来。由于这些酶的序列高度保守，研究重点放在了比活性最高的PO1上。实验结果表明，PO1的酶学特性与大多数虾类的酚氧化酶相似，其最佳反应条件为35℃、pH 6.0。通过基于结构的虚拟筛选和PO1抑制实验，研究人员发现了五种新型的PO1抑制剂（谷氨酸，

CRediT作者贡献说明

徐琪：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，方法学，研究实施，正式分析，数据整理，概念构建。宋俊毅：写作——审阅与编辑，验证，方法学，研究实施，正式分析。刘春辉：写作——审阅与编辑，验证，方法学，研究实施。王赛：资源提供，项目管理，方法学，研究实施。李娇：写作——审阅与编辑，资源提供，项目管理，方法学，研究实施，资金支持

未引用参考文献

李等人，2024年；蒙特罗等人，2001年。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

数据可用性

本研究中使用的数据属于保密信息。

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32572663）以及中国农业研究系统专项基金CARS-48的支持。

徐琪|宋俊毅|刘春辉|王赛|李娇|毛向昭

中国海洋大学食品科学与工程学院海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，中国山东省青岛市266404