用于无标记检测重金属离子且抗干扰能力更强的工程化适配体封载水凝胶

《Food Chemistry》：Engineered aptamer-confined hydrogel for label-free detection of heavy-metal ions with enhanced interference tolerance

　　

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  水凝胶限制作用可调控适配体构象以实现目标识别。
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  经三位点修饰的适配体水凝胶的亲和力比游离适配体高3.1倍。
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  适配体被限制在特定结构后，能在恶劣条件下更好地抗干扰。
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  在适配体受限的水凝胶中可实现无需标记的Pb²⁺和Cd²⁺检测。

引言

铅离子是一种难以降解的重金属污染物，广泛存在于食物、环境及生物样本中（Collin等人，2022）。低浓度的铅离子也会带来严重健康风险，包括神经系统、心血管系统、肾脏功能以及发育方面的问题（Ren等人，2022）。美国环境保护局规定饮用水中铅的含量上限为0.015毫克/升。因此，准确可靠地检测铅离子对于保障食品安全、环境监测以及公共健康至关重要。传统的分析方法，如原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、电感耦合等离子体原子发射光谱法以及X射线荧光光谱法，虽然具有较高的准确度和灵敏度，但这些方法通常需要昂贵的仪器、专业的操作人员，且样品前处理流程复杂，难以用于快速现场检测。因此，亟需开发一种简单有效的铅离子检测方法。

适配体是一种在体外筛选出的单链核酸，能够特异性识别目标分子或离子（Qin等人，2024）。由于其具有高亲和力、良好特异性、化学稳定性、易于修饰以及可大规模合成等优点（Shin等人，2023），适配体被广泛用作生物传感器中的识别元件。不过，适配体的检测性能在很大程度上取决于其与目标结合的构象，而寡核苷酸的固有灵活性容易受到pH值、离子强度、有机溶剂以及核酸酶降解等环境因素的影响（Barr等人，2024；Qian等人，2024；Yu等人，2016；Nishio等人，2021；Zhu等人，2024），这些因素都可能降低其在复杂环境中的识别能力。尽管人们已经通过环化、末端固定以及核苷酸修饰等方法来提高适配体的稳定性（Ai等人，2022；Zhao等人，2019；Zhou等人，2022），但这些方法仍可能需要依赖目标诱导的构象重排，无法彻底解决在恶劣条件下识别能力不稳定的问题。

如果能让适配体预先形成目标识别构象，就能减少构象重排带来的影响，同时降低环境因素的干扰。先前的研究表明，分子限制或拥挤效应可以促进功能性核酸的正确折叠，进而提升其结合或催化性能（Ji等人，2024；Peng等人，2022）。分子印迹聚合物也能提供特定的空腔和多种相互作用位点，为适配体限制提供了良好的平台（L. Wu等人，2021）。然而，目前大多数适配体印迹系统主要侧重于在适配体上引入可聚合基团（Geng等人，2024；Tao等人，2025），而锚定位点的数量、位置以及功能单体特性对适配体识别能力的综合影响仍缺乏足够研究。此外，由于限制效应的存在，那种依赖结构切换的典型信号输出模式并不适用于预先形成特定构象的适配体（Yang等人，2021）。因此，亟需一种合适的信号转导方法来探索这类适配体的传感应用潜力。

在本研究中，我们提出这样一个假设：将适配体多位置共锚定在水凝胶网络中，能够稳定其受限的识别构象，从而提升其对目标的亲和力、耐盐性以及抗干扰能力。为了验证这一假设，我们设计了一种适配体受限水凝胶策略，用于无需标记地检测铅离子的荧光信号。如图1所示，Pb²⁺与适配体形成的复合物通过原位聚合被封装在水凝胶中。去除Pb²⁺后，具有目标结合构象的适配体就被限制在三维聚合物网络中。这种受限状态的适配体还能作为铽离子发光的敏化剂，通过Pb²⁺结合所引发的荧光淬灭以及铽离子敏感微环境被破坏的现象，实现铅离子的检测。我们系统研究了可聚合基团的数目和位置以及功能单体的电荷特性对受限适配体识别能力的影响。此外，还在不同干扰条件下以及真实样品环境中，将这种适配体受限水凝胶的检测性能与游离适配体进行了对比。最后，通过研究镉离子适配体受限水凝胶的情况，进一步验证了所开发方法的通用性。这项工作为理解适配体结构与其功能性能之间的关系提供了新的视角。

章节要点

试剂

丙烯酰胺（AAm，纯度99.0%）、N,N-亚甲基双丙烯酰胺（MBA，纯度97.0%）、2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸（APMS，纯度98.0%）均购自上海麦克林生化有限公司。N-异丙基丙烯酰胺（NIPAAm，纯度98.0%）、过硫酸铵（APS，纯度98.0%）、十二烷基硫酸钠（SDS，纯度98.5%）、MES一水合物（MES，纯度99.0%）、六水合硝酸铽（Tb(NO₃)₃·6H₂O，纯度99.9%）、甲醇（纯度99.7%）、二甲基氨基丙基甲基丙烯酰胺（DMPA，纯度98.0%），以及硝酸铅标准品。

表征与可行性验证

透射电子显微镜图像显示，适配体水凝胶的形态不规则，平均尺寸约为280纳米（图1A）。能量色散X射线光谱分析结果显示，C、N、O、P元素分布均匀，其中磷的含量为0.16重量百分比（图1B及表S2），这一结果证实了适配体已嵌入水凝胶网络中。傅里叶变换红外光谱用于分析适配体水凝胶中的功能基团（图1C），在3456厘米^-1处可观察到O–H/N–H伸缩振动峰，在1545厘米^-1处可观察到C=C/C–O振动峰。

结论

在本研究中，我们通过分子印迹技术开发了一种水凝胶限制策略，用以稳定适配体的识别构象。研究发现，适配体链上丙烯酰胺修饰的数目及其空间分布对于在受限水凝胶系统中保持高结合亲和力至关重要。此外，通过调节功能单体的电荷特性及其含量来优化水凝胶微观环境，还能进一步提升适配体的结合亲和力。

CRediT作者贡献说明

白龙：论文撰写——审阅与编辑，论文撰写——初稿撰写，方法学研究，实验分析，概念构思。 吴秀秀：软件应用，实验资源准备，方法学研究，实验分析。 黄磊：方法学研究，实验分析，数据整理。 陈浩浩：实验分析，定量数据分析。 余金松：方法学研究，实验分析，数据整理。 叶子青：方法学研究，实验分析。 袁敏：方法学研究，实验分析。 曹辉：方法学研究，实验分析，定量数据分析。 郝丽玲：结果可视化，实验结果验证。

伦理声明

作者声明本研究未涉及人类或动物实验对象。

未引用参考文献

Meier等人，2018年。

利益冲突声明

作者声明自己不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益关系或个人关系。

致谢

本项研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：32272421、32072312）以及上海 Rising-Star 计划（项目编号：22QA1406500）的资助。

白龙|吴秀秀|黄磊|陈浩浩|余金松|叶子青|袁敏|曹辉|郝丽玲|尹凤琴|叶泰|徐飞