《Food Chemistry: X》：Unraveling the mechanism of “smelling slightly off but tasting delicious” of fermented sour pork via multi-omics analysis: insights from microbial community analysis, flavoromics, untargeted metabolomics and targeted metabolomics
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在本研究中，研究人员通过多组学技术（multi-omics）系统探索了发酵酸肉（FSP）在不同发酵过程中的动态变化。酯类、醇类和萜类化合物为FSP提供了果香、酒香和草本香气，是愉悦风味的主要成分。发酵与蛋白质、脂质和碳水化合物的深度降解相关。随着发酵时间的延长
在本研究中，研究人员通过多组学技术（multi-omics）系统探索了发酵酸肉（FSP）在不同发酵过程中的动态变化。酯类、醇类和萜类化合物为FSP提供了果香、酒香和草本香气，是愉悦风味的主要成分。发酵与蛋白质、脂质和碳水化合物的深度降解相关。随着发酵时间的延长，氨基酸、肽类和脂肪酸衍生物的富集是FSP“吃着香”的主要贡献物质，60天FSP中的游离氨基酸（FAA）含量增加了8.82倍。值得注意的是，风味物质(+/-)-4-松油醇、苯乙醇、1-辛烯-3-酮和1-庚烯-3-酮表现出浓度依赖性香气特征，可能贡献不良风味。同时，丁烷-1,4-二胺和脂质氧化产物的逐渐形成可能促进了FSP特征性挥发性“闻着微臭”风味的形成。这为FSP的风味调控和工业生产提供了理论基础。
发酵酸肉（FSP）是一种广泛流行于中国西南部（贵州、湖南、江西）的传统发酵肉制品，以其“闻着微臭但吃着香”的特征风味而闻名。在发酵食品中，微生物和内源酶催化碳水化合物、脂质和蛋白质的复杂代谢反应，生成营养物质和风味化合物。许多传统发酵食品（如东南亚鱼露、日本纳豆、韩国洪鱼脍、法国蓝纹奶酪）均不同程度地带有特征性“不良气味”。中国也存在大量类似“闻着微臭但吃着香”的发酵食品，如海南鱼茶、福建鱼露、安徽臭鳜鱼、广西酸笋。尽管气味略显不悦，这些传统自然发酵食品仍深受消费者喜爱，失去这种独特“臭”味将使其失去风味“灵魂”。FSP通常由五花肉与米粉、调味料在密封陶罐中于室温发酵30-60天制成，其风味由多样微生物群落间的相互作用塑造。然而，由于FSP发酵过程漫长且复杂，微生物演替以及挥发性和非挥发性风味化合物的形成机制仍不明确。近年来，多组学方法已成为阐明发酵食品风味形成机制的有力工具，包括电子鼻、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、气相色谱-嗅闻（GC-O）、顶空固相微萃取（HS-SPME/GC-MS）、高通量测序（16S/18S/ITS扩增子测序）及代谢组学技术。但迄今尚缺乏整合微生物群落分析、风味组学、非靶向代谢组学和靶向代谢组学以揭示发酵肉制品“闻着微臭但吃着香”风味形成机制的研究。基于前期观察，研究人员提出两个工作假设：第一，特征性“微臭”源于特定气味活性挥发性化合物的积累，其感官感知在发酵过程中呈现浓度依赖性效应；第二，FSP的良好食用品质可能源于非挥发性滋味活性代谢物（如氨基酸、有机酸、核苷酸）的同时积累，通过跨模态气味-滋味相互作用部分补偿或掩盖不良气味。为验证这些假设，研究人员以实验室制备的不同发酵阶段（0天、30天、60天）的FSP为研究对象，整合理化指标、微生物群落分析、风味组学、非靶向代谢组学和靶向代谢组学，阐明了FSP发酵过程中复杂风味轮廓和微生物群落的动态演变。该工作为FSP“闻着微臭但吃着香”现象提供了分子基础新见解，为风味调控和工业化生产提供理论依据。论文发表在《Food Chemistry: X》。
研究人员主要采用以下关键方法：使用16S rRNA基因扩增子测序（V3-V4区，Illumina平台）分析微生物群落结构；采用HS-SPME/GC-MS结合NIST库和保留指数鉴定挥发性风味化合物；通过UHPLC-Q-Orbitrap-MS/MS进行非靶向代谢组学分析（正负离子模式），并利用UHPLC-Qtrap LC-ESI-MS/MS进行靶向代谢组学定量游离氨基酸；同时测定pH、总酸、TVB-N及有机酸（HPLC）等理化指标。样本来源于实验室制备的FSP（三个独立发酵批次，每批次为一个生物重复），原料购自当地超市。
研究结果如下：
3.1 理化指标分析：通过测定pH、TVB-N、总酸及有机酸含量，发现pH持续下降，从0天的5.78降至60天的4.08；TVB-N值虽升高但始终远低于安全限（≤15 mg/100g）；总酸含量显著增加，乳酸为最主要有机酸，从4.81 mg/g升至25.42 mg/g，而苹果酸、琥珀酸和草酸含量保持较低水平，为质量控制和风味形成提供基础。
3.2 细菌群落演替：通过16S rRNA扩增子测序及Venn图、PCoA分析，发现发酵过程中微生物多样性逐渐降低，共有25个OTU（操作分类单元）存在于所有阶段，而特有OTU从0天的656个锐减至60天的9个。门水平上，Firmicutes（厚壁菌门）在60天成为绝对优势门（99.49%）；属水平上，Lactobacillus（乳杆菌属）和Pediococcus（片球菌属）成为核心优势属，30天时Lactobacillus sakei（清酒乳杆菌）相对丰度达73.86%，60天时演变为Lactiplantibacillus plantarum（植物乳杆菌，32.53%）和Lentilactobacillus garvieae（格氏乳杆菌，46.79%）。LEfSe分析进一步鉴定出Lactobacillus plantarum、Lactobacillus sakei、Pediococcus pentosaceus等关键差异菌种。
3.3 挥发性物质分析：通过HS-SPME/GC-MS结合预测气味特征雷达图、火山图、OPLS-DA及VIP分析，发现酯类、醇类和萜类化合物（如乙醇、(±)-芳樟醇、柠檬烯、桉叶油醇）是愉悦风味的主要贡献者，赋予果香、酒香和草本香。随着发酵进行，30天时核心差异挥发性物质包括乙醇、(±)-芳樟醇、(Z,Z)-柠檬烯和苯乙醇；60天时乙醇、乙酸、酯类及脂肪酸衍生物成为主导标志物。ROAV分析表明，(±)-芳樟醇、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯和乙酸乙酯的ROAV值显著增加，成为关键风味活性组分。值得注意的是，(+/-)-4-松油醇、苯乙醇、1-辛烯-3-酮和1-庚烯-3-酮表现出浓度依赖性香气特征：高浓度时贡献霉味、泥土味和金属味，低浓度时呈现蘑菇味和肉味，可能构成“微臭”来源。丁烷-1,4-二胺和脂质氧化产物也参与了“微臭”特征的形成。KEGG通路拓扑分析显示，30天时主要代谢通路为甲苯降解、己内酰胺降解、氨基苯甲酸降解和丙酮酸代谢；60天时转变为甲苯降解、乙苯降解、生物碱生物合成、柠檬烯降解和单萜生物合成。
3.4 非挥发性物质分析：
3.4.1 非靶向代谢组学分析：通过PLS-DA、Venn图、火山图、雷达图、聚类热图和VIP分析，共检测到1935种差异代谢物，其中60天阶段特有代谢物285种（14.59%）。HMDB数据库注释显示，氨基酸、肽及其类似物占比最高（24.18%），其次为脂肪酸及共轭物（4.37%）、碳水化合物及共轭物（4.07%）。KEGG富集分析表明，差异代谢物主要富集于氨基酸代谢、脂质代谢和碳水化合物代谢途径。30天时，核心差异代谢物以脂质代谢物（如4-羟基丁酸）和糖苷为主；60天时，氨基酸和胺类（如色氨酰-苏氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、甲基赖氨酸）成为核心，蛋白质水解和氨基酸代谢驱动中后期代谢差异。丁烷-1,4-二胺等胺类化合物在发酵中显著积累，可能与“微臭”特征相关。
3.4.2 游离氨基酸含量：通过靶向代谢组学定量游离氨基酸（FAA）并计算滋味活性值（TAV），发现总游离氨基酸（TAA）含量从0天的289.33 mg/g显著增至60天的2551.96 mg/g（8.82倍）。鲜味氨基酸中，谷氨酸（Glu）的TAV从0.73升至11.31，天冬氨酸（Asp）的TAV在60天达到1.16，成为鲜味的主要贡献者。甜味氨基酸中，丙氨酸（Ala）的TAV从0.63升至3.23，贡献显著甜味。苦味氨基酸中，蛋氨酸（Met）的TAV最高（5.31），组氨酸（His）为4.89，赖氨酸（Lys）为3.18，异亮氨酸（Ile）为2.01，精氨酸（Arg）为1.55，亮氨酸（Leu）为1.42，缬氨酸（Val）为1.22，但最终产品未呈现过度苦味，可能因鲜味和甜味化合物的协同作用而缓解。整体上，FSP形成了“鲜（Glu/Asp）-甜（Ala/Gly）-微苦（Met/His/Lys）”的复合滋味体系。
总结讨论部分，本研究通过非靶向和靶向代谢组学联合分析，系统阐述了FSP风味的特征物质及形成规律。发酵过程中乳酸持续积累，TVB-N保持在安全范围内；酯类、醇类和萜类（如芳樟醇、2-甲基丁酸乙酯、异戊酸乙酯）贡献果香、酒香和草本香，构成核心愉悦风味；60天FSP中游离氨基酸增加8.82倍，形成“鲜（Glu/Asp）-甜（Ala/Gly）-微苦（Met/His/Lys）”的复合滋味；轻微不良气味主要源于(+/-)-4-松油醇、苯乙醇、1-辛烯-3-酮和1-庚烯-3-酮，这些化合物在先前研究中被报道具有浓度依赖性感官特征；丁烷-1,4-二胺和脂质氧化产物进一步增强了酸肉的典型微臭特征。该工作初步阐明了FSP风味形成的分子基础，为精准风味调控和标准化工业制造提供了关键理论指导。未来需通过多个独立发酵批次验证微生物和代谢变化的重复性，并结合绝对定量、香气重组和缺失实验进一步验证该机制。
