猪气管软骨的比较酶解产生具有增强生物活性的ACE/DPP-IV抑制肽和抗氧化肽：模拟胃肠消化及分子对接分析

《Food Chemistry: X》：Comparative enzymatic hydrolysis of porcine tracheal cartilage generates ACE/DPP-IV-inhibitory and antioxidant peptides with enhanced bioactivity following simulated gastrointestinal digestion and molecular docking analysis

　　

猪气管软骨是一种未被充分利用的富含II型胶原的副产物，本研究系统评估了其作为血管紧张素I转换酶（ACE）抑制肽、二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制肽和抗氧化肽来源的潜力。在4小时水解时，中性蛋白酶（Neutrase）在生成ACE抑制肽和抗氧化肽方面优于木瓜蛋白酶（Papain）。<3 kDa的超滤组分富含疏水性小分子肽，表现出最高的生物活性。液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定出8个序列（分子量870–1565 Da）。化学合成证实，LGLGADMFHR是最有效的ACE抑制剂（半抑制浓度IC₅₀=0.52 mM），QGLPGPGAVAEYT是主要的DPP-IV抑制剂（IC₅₀=1.84 mM），而LGFGADRAGPQ是最强的抗氧化肽（5.64 mM Trolox当量）。分子对接揭示，LGLGADMFHR通过与Cys352、Glu376和Asp453形成Zn²⁺配位和氢键结合。标准化的INFOGEST模拟胃肠消化逐步增强了ACE抑制和抗氧化活性，而DPP-IV抑制活性则下降，从而确立了猪气管软骨作为胃肠道稳定的心血管生物活性肽的可行来源。

**研究背景与问题**

全球肉类加工行业每年产生约5000万吨副产物，占牲畜胴体重量的30-40%。酶解可将这些富含蛋白质的材料转化为具有健康促进特性的生物活性肽，包括用于血压调节的血管紧张素I转换酶（ACE）抑制、用于血糖控制的二肽基肽酶-IV（DPP-IV）抑制以及抗氧化能力。由于传统用于血压和血糖控制的合成药物可能引起不良反应，因此食源性肽提供了一种更安全的天然替代品，并为功能性成分的开发指明了方向。富含胶原的组织是屠宰场副产物的主要组成部分，但与皮肤、骨骼和鱼类来源相比，对气管软骨的研究要少得多。气管软骨主要是一种细胞外基质，其中II型胶原占总胶原组分的约90-95%，其组成与大多数已研究来源的I型胶原不同；这种差异，加上其显著较低的脂肪含量，可能在酶解后产生新的肽序列。目前对猪气管软骨的研究主要集中在其结构和营养保健成分上，尚未评估其酶解产物的ACE抑制、DPP-IV抑制或抗氧化肽活性，且其组成肽序列仍未被鉴定。基于脯氨酸和羟脯氨酸丰富的二肽和三肽而具有良好吸收特性的胶原衍生肽，以及气管被视为最未被充分利用的动物副产物之一，这构成了本研究旨在填补的明确且未解决的空白。

**研究内容与结论**

研究人员系统地评估了猪气管软骨作为生物活性肽生成底物的潜力，整合了比较蛋白酶评估、基于大小的分级分离和肽表征，以建立决定ACE抑制、DPP-IV抑制和抗氧化能力的构效关系。随后通过模拟胃肠消化评估所得肽在消化蛋白水解过程中是否保留功能，这是口服生物利用度的先决条件。研究结果表明，蛋白酶的选择应根据目标特异性构效关系进行指导，而不是仅依据水解度或蛋白质得率。中性蛋白酶（Neutrase）虽然水解度低于木瓜蛋白酶（Papain），但由于其选择性水解产生了富含疏水性小分子肽的肽群，因此在ACE抑制和抗氧化活性方面表现更优。超滤分级分离证实，低于3 kDa的肽在心血管相关生物活性方面表现最佳。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）鉴定出8个来源于II型胶原的肽序列；化学合成和实验测定证实，LGLGADMFHR是最有效的ACE抑制剂（半抑制浓度IC₅₀=0.52 mM），QGLPGPGAVAEYT是主要的DPP-IV抑制剂（IC₅₀=1.84 mM），而LGFGADRAGPQ是最强的抗氧化肽（5.64 mM Trolox当量）。分子对接解析了其结合机制，涉及与催化残基的锌离子配位和广泛的氢键作用。最重要的是，标准化的INFOGEST模拟胃肠消化将ACE抑制活性增强至91.3%，并逐步提高了抗氧化能力，证明了在此类胶原衍生肽中鲜有报道的隐秘生物活性释放现象。该研究确立了猪气管软骨作为功能性食品成分中具备胃肠稳定性的心血管生物活性肽的可行来源。论文发表在《Food Chemistry: X》。

**主要关键技术方法**

1. **酶解与比较蛋白酶筛选**：使用中性蛋白酶（Neutrase，来自枯草芽孢杆菌）和木瓜蛋白酶（Papain，来自番木瓜）在各自最佳温度下对碱性预处理后的猪气管软骨进行水解，不进行外部pH调节，以比较不同酶类对生物活性肽生成的影响。
2. **超滤分级分离**：对4小时中性蛋白酶水解物进行超滤，通过不同截留分子量（MWCO）膜（10 kDa和3 kDa）分离出>10 kDa、3-10 kDa和<3 kDa三个组分，以评估分子量大小与生物活性之间的关系。
3. **反相闪式色谱（RP-Flash）纯化与肽鉴定**：对生物活性最高的<3 kDa超滤组分进行反相闪式色谱分离，根据疏水性进一步分级，并使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对活性最高的组分进行肽序列鉴定。
4. **模拟胃肠消化与分子对接**：采用标准化的INFOGEST体外消化模型评估水解物的胃肠稳定性。同时，对鉴定出的最有效ACE抑制肽（LGLGADMFHR）和DPP-IV抑制肽（QGLPGPGAVAEYT）进行分子对接，以阐明其与目标酶（ACE和DPP-IV）的结合机制。

**研究结果**

**3.1. 碱性预处理猪气管软骨的近似组成**
碱性预处理显著富集了蛋白质组分（干基从76.24%增至97.11%），同时将总脂质含量降至1.15%（干基），灰分降至1.75%（干基），确立了该材料作为酶解底物的适宜性，该过程导致约21%的初始干固形物损失。

**3.2. 酶解与活性依赖性生物活性关系**
中性蛋白酶水解物在FRAP（铁还原抗氧化能力）、金属螯合活性和ABTS自由基清除活性方面均优于木瓜蛋白酶，尽管其水解度较低。在ACE抑制活性方面，中性蛋白酶同样表现更优（6小时时达77.42%对比木瓜蛋白酶的70.46%），表明ACE抑制效力取决于特定肽序列的生成，而非水解程度。相反，木瓜蛋白酶在DPP-IV抑制方面表现更佳，表明其需要更广泛的肽多样性。

**3.3. 分子量分布与活性依赖性大小关系**
尽管中性蛋白酶整体水解度较低，但其水解物中低于3 kDa肽的比例是木瓜蛋白酶水解物的1.3倍，这解释了其更好的ACE抑制活性。小分子肽（<3 kDa）在ACE抑制和抗氧化功能方面表现出更强的生物活性。

**3.4. 超滤分级分离与大小依赖性生物活性**
<3 kDa的超滤组分（UF3）在蛋白质回收率、总α-氨基含量以及所有抗氧化指标（FRAP、金属螯合、ABTS）和ACE抑制活性方面均显著高于其他组分。相反，DPP-IV抑制活性表现为相反的大小依赖性，较大的组分（>10 kDa，UF1）表现出更高的抑制率。Pearson相关性分析证实，分子量与DPP-IV抑制呈强正相关（r=+1.00），与抗氧化和ACE抑制呈强负相关。

**3.5. 反相闪式色谱与疏水性-生物活性关系**
通过反相闪式色谱分离出的五个组分（F1-F5）中，疏水性最强的F5组分在所有抗氧化指标和ACE抑制活性方面均表现最佳。ACE抑制活性与疏水性强相关，F5的抑制率（20.03%）显著高于F1（2.82%），确立了小分子量（<3 kDa）与高疏水性结合是ACE抑制的优化条件。DPP-IV抑制活性也表现出中等程度的疏水性依赖性。

**3.6. 肽序列鉴定与计算机模拟表征**
LC-MS/MS分析鉴定出8个分子量范围为870-1565 Da的肽序列，均来源于II型胶原。化学合成后实验验证表明，LGLGADMFHR是ACE的最强抑制剂（IC₅₀=0.52 mM），QGLPGPGAVAEYT是DPP-IV的最强抑制剂（IC₅₀=1.84 mM），而LGFGADRAGPQ是抗氧化活性最强的肽（ABTS，5.64 mM Trolox当量）。计算机模拟预测所有序列均为非毒性。

**3.7. 最有效肽抑制剂的分子对接与结合机制**
分子对接显示，LGLGADMFHR与ACE活性位点的Zn²⁺离子形成配位，并与Cys352、Glu376和Asp453等残基形成氢键。QGLPGPGAVAEYT则与DPP-IV的催化残基Ser630和His740形成氢键，并与Trp124形成酰胺-π堆积相互作用，阐明了其抑制作用的分子机制。

**3.8. 模拟胃肠消化过程中的稳定性与生物活性转化**
标准化的INFOGEST模拟消化后，总α-氨基含量显著增加，分子量向更小范围转变（<1000 Da肽从46.50%增至54.04%）。关键的是，ACE抑制活性从消化前的73.5%逐步增强至消化后的91.3%，抗氧化活性（FRAP、金属螯合、ABTS）也显著增强。相反，DPP-IV抑制活性则下降了35%。这表明水解物在胃肠道中保留了并增强了心血管相关的生物活性，而非降解。

**总结与讨论**

本研究确立了猪气管软骨作为通过酶解生成多功能生物活性肽的可行底物，填补了胶原副产物高值化利用的关键空白。比较蛋白酶评估表明，中性蛋白酶（Neutrase）虽水解度较低，但因生成富含疏水性小分子肽的肽群，在ACE抑制和抗氧化活性上优于木瓜蛋白酶（Papain），挑战了高水解度等同于高生物活性的简单假设。系统的分子量分级分离证实，<3 kDa的肽展现出最优的心血管生物活性，而反相色谱则表明高疏水性进一步增强ACE抑制。通过LC-MS/MS鉴定并经化学合成验证的8个肽序列，确认了LGLGADMFHR（ACE抑制IC₅₀=0.52 mM）、QGLPGPGAVAEYT（DPP-IV抑制IC₅₀=1.84 mM）和LGFGADRAGPQ（抗氧化5.64 mM Trolox当量）为最具潜力的候选物。分子对接从原子水平解析了其结合机制。

**结论部分翻译如下：**
本研究确立了猪气管软骨作为通过酶解生成多功能生物活性肽的可行底物，解决了胶原副产物高值化利用中的关键空白。比较蛋白酶评估表明，中性蛋白酶（Neutrase）在ACE抑制活性上更优（用于下游分析的4小时水解物为73.5%），尽管其水解度低于木瓜蛋白酶（Papain），这挑战了将广泛蛋白水解与增强生物活性等同起来的简单假设，并揭示了活性依赖性构效关系。系统的分子量分级分离证实，低于3 kDa的肽表现出最佳的心血管生物活性，反相色谱则表明高疏水性进一步增强ACE抑制。LC-MS/MS从II型胶原中鉴定出8个生物活性序列（870–1565 Da）；化学合成和实验测定确认LGLGADMFHR是最有效的ACE抑制剂（IC₅₀=0.52 mM），QGLPGPGAVAEYT是主要的DPP-IV抑制剂（IC₅₀=1.84 mM），而LGFGADRAGPQ是最强的抗氧化剂（5.64 mM Trolox当量）。分子对接阐明了涉及锌离子配位和与催化残基形成广泛氢键的结合机制，为构效关系提供了分子水平见解。最重要的是，标准化的INFOGEST模拟胃肠消化将ACE抑制活性增强至91.3%，并逐步提高了抗氧化能力，证明了在此类胶原衍生肽中鲜有报道的隐秘生物活性释放现象。虽然整体生物活性测量无法提供明确的机制判断，且体内功效研究对于临床转化仍至关重要，但这些发现将气管肽定位为针对高血压和氧化应激的功能性食品中有前景的清洁标签成分。总之，本研究展示了在可持续肉类加工废弃物高值化利用中，整合比较酶评估、基于大小的分级分离、序列鉴定和胃肠稳定性评估的转化价值。