整合多组学分析鉴定中枢神经系统自身免疫的微生物和代谢特征及驱动因素

《mSystems》：Integrated multi-omics analysis identifies microbial and metabolic signatures and drivers of CNS autoimmunity

　　

多发性硬化（MS）是一种由遗传和环境因素驱动的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病。MS患者（pwMS）的肠道微生物组具有独特性，并通过产生免疫调节代谢物影响疾病。pwMS中循环代谢物发生改变，但鉴定微生物-代谢驱动因素仍具挑战性。研究人员先前表明，肠道共生菌罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）的定植以色氨酸依赖性方式加剧了MS的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中的疾病。在此，研究人员整合了来自一项纵向EAE研究的微生物组学和代谢组学数据集，该研究利用了在定植或不定植L. reuteri的小鼠中给予高色氨酸和低色氨酸饮食。在色氨酸生物利用度的短期和长期改变下，肠道微生物组动态受到饮食、微生物组背景或疾病的影响。在短期饮食干预期间，L. reuteri定植对微生物组组成的影响大于色氨酸生物利用度。随着更长的饮食暴露和EAE进展，高饮食色氨酸和L. reuteri定植协同作用引发了深刻的微生物群变化，包括Lachnospiraceae、Blautia和Akkermansia的改变。使用联合稳健Aitchison主成分分析（PCA）整合代谢组学和微生物组学数据集揭示了关联代谢物和微生物群的聚类，这些聚类富集了功能通路，包括胆汁酸和色氨酸代谢。代谢物在预测EAE严重程度方面优于微生物群，将p-cresols和indoles确定为最重要的疾病相关代谢物。用p-cresol或3-indoleglyoxylic酸治疗加重了EAE，增强了促炎性T细胞反应，并增加了小脑病理。这些数据表明，饮食反应受肠道微生物组组成的影响，并且整合的微生物组学-代谢组学分析可以识别MS中疾病恶化的驱动因素。

多发性硬化（MS）是一种由遗传和环境因素共同驱动的中枢神经系统（CNS）慢性自身免疫性疾病，其全球患病率持续上升。尽管遗传因素贡献约30%的疾病风险，但环境因素（如饮食、肠道微生物组组成）及基因-环境相互作用占主导地位。已有研究证实，MS患者（pwMS）的肠道微生物组组成与健康对照存在显著差异，包括短链脂肪酸（SCFA）产生菌减少、阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）水平改变等。同时，pwMS的血清、血浆及粪便代谢物谱也发生改变，如胆汁酸（BAs）和色氨酸（Trp）相关代谢物水平异常。然而，肠道微生物组、饮食及免疫调节代谢物之间的具体相互作用及其在MS发病和恶化中的驱动机制尚不明确。为阐明这一问题，研究人员利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）小鼠模型（MS的经典模型），通过纵向设计整合多组学数据，旨在鉴定微生物和代谢特征及其对CNS自身免疫的驱动作用。该研究发表在《mSystems》。

研究人员采用的主要关键方法包括：使用全长度16S（FL16S）测序分析粪便微生物组组成；通过超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）检测血清代谢组；采用联合稳健Aitchison主成分分析（jRPCA）整合微生物组和代谢组数据，识别微生物-代谢物关联聚类；利用随机森林回归模型预测EAE累积疾病评分（CDS），筛选重要特征；并通过在饮用水中给予候选代谢物（p-cresol和3-indoleglyoxylic酸）进行功能验证，结合流式细胞术评估脊髓免疫细胞浸润，以及H&E和Luxol Fast Blue（LFB）染色评估小脑病理。样本来源于无菌C57BL/6小鼠移植B6或B6+L. reuteri肠道微生物后建立的垂直传播模型，以及来自Jackson Laboratory的常规SPF C57BL/6J小鼠。

研究结果部分如下：

**L. reuteri colonization impacts microbial dynamics more than short-term dietary tryptophan intervention**
通过分析饮食干预1周后的粪便FL16S数据，研究人员发现L. reuteri定植对微生物组β多样性（未加权UniFrac距离）的影响显著大于色氨酸生物利用度；而饮食本身对β多样性无显著影响，且与微生物组无交互作用。差异丰度分析（LinDA）显示，L. reuteri定植导致A. muciniphila、Lactobacillus johnsonii、Turicibacter等ASV扩增，并调节Lachnospiraceae和Oscillibacter成员。在B6微生物组背景下，饮食未显著改变任何ASV；而在B6+L. reuteri背景下，仅高色氨酸饮食使单个ASV轻度增加。这些结果表明，短期饮食干预下，L. reuteri定植是微生物组组成变化的主要驱动力。

**Modification of dietary tryptophan bioavailability during EAE progression alters gut microbiome composition in a microbiota composition-dependent manner**
在饮食干预5周（EAE病程结束）后，研究人员发现饮食和微生物组对α多样性（Shannon指数）和β多样性均有显著影响，且存在饮食×微生物组交互作用。L. reuteri定植导致A. muciniphila和两个Blautia coccoides ASV扩增，并显著耗竭SCFA产生菌Lachnospiraceae NK4A136。高色氨酸饮食在B6+L. reuteri背景下显著降低A. muciniphila，同时扩增Alistipes、Lachnospiraceae和Colidextribacter成员。相反，在B6微生物组背景下，饮食未引起显著ASV变化。这些数据表明，EAE进展和长期饮食暴露对微生物组的影响依赖于L. reuteri定植，且高色氨酸加剧了L. reuteri的微生物组重塑效应。

**Tryptophan bioavailability and L. reuteri colonization alter gut microbiome temporal dynamics**
通过比较同一小鼠在1周和5周时间点的配对粪便样本，研究人员发现B6+L. reuteri微生物组在时间尺度上表现出更动态的变化。在低色氨酸饮食下，B6微生物组α多样性随时间下降；而在高色氨酸饮食下，B6+L. reuteri微生物组α多样性显著增加。β多样性分析显示，无论饮食如何，B6微生物组随时间无显著组成变化；而B6+L. reuteri微生物组在两种饮食下均随时间变化，且高色氨酸饮食下变化更显著（R² = 0.50 vs 0.27）。差异丰度分析表明，B6+L. reuteri小鼠中随时间变化的ASV数量远多于B6小鼠，尤其是在高色氨酸饮食下（71 vs 9个ASV），包括Blautia coccoides、Colidextribacter扩增，以及L. reuteri自身丰度下降。这些结果提示，L. reuteri定植的肠道微生物组在长期饮食暴露和EAE进程中更为动态，且高色氨酸促进这一动态变化。

**Multiomic integration reveals functionally distinct microbe:metabolite associations**
利用jRPCA整合匹配的粪便FL16S和血清代谢组数据，研究人员在总数据集中识别出三个显著的微生物-代谢物聚类，分别富集胆汁酸、嘌呤核苷酸和吲哚/甲酚（色氨酸衍生代谢物）。层次聚类和通路富集分析进一步定义了7个代谢物聚类和11个微生物聚类，其中聚类3富集胆汁酸生物合成，聚类7富集色氨酸代谢和烟酸/烟酰胺代谢。相关性网络分析揭示，胆汁酸聚类中与Lachnospiraceae、Oscillospiraceae等Clostridia类群密切关联，而L. reuteri对应的ASV74也位于胆汁酸亚簇中；色氨酸代谢聚类则包含更多样化的微生物类群，包括Muribaculaceae、Bacilli和Clostridia。这些分析整合了复杂的微生物和代谢特征，识别出主要变异来源及新关联。

**Bile acids, tryptophan metabolites, and associated microbiota robustly delineate groups by dietary context and time**
按微生物组背景（B6或B6+L. reuteri）子集化后，jRPCA分析显示样本沿主成分1和2按饮食和时间点清晰分离。在B6微生物组中，高色氨酸饮食与嘌呤核苷酸代谢物（如鸟苷、黄嘌呤）和吲哚丙烯酸酯相关，低色氨酸饮食与胆汁酸（如牛磺鹅去氧胆酸）及Roseburia、Blautia相关。在B6+L. reuteri微生物组中，高色氨酸饮食与色氨酸代谢物（犬尿喹啉酸、喹啉酸）和p-cresol（p-cresol-葡萄糖苷酸和p-cresol-硫酸酯）相关，低色氨酸饮食与胆汁酸和A. muciniphila、Faecalibaculum rodentium相关。两种微生物组背景下，胆汁酸均与1周时间点关联，提示其在EAE病程中随时间耗竭。这些数据揭示了饮食和疾病状态的微生物及代谢特征，且这些特征因微生物组背景而异。

**Identification of microbial and metabolic signatures predicting EAE severity**
利用随机森林回归模型分别基于微生物组、代谢组或整合数据预测EAE CDS，研究人员发现代谢组模型预测性能优于微生物组模型（Pearson相关系数0.834 vs 0.599，解释方差59.9% vs 29.7%）。微生物组模型中，Anaerotruncus、Lachnospiraceae和Muribaculaceae ASV贡献较大；代谢组模型中，色氨酸相关代谢物和NAD+代谢物及胆汁酸为Top特征，其中p-cresols和indoles（如3-indoleglyoxylic酸）排名靠前。整合模型的Top30特征主要由代谢物主导，包括p-cresols和sphingomyelin代谢物，以及两个ASV（Anaerotruncus和Clostridia UCG.014）。这些结果表明，在色氨酸饮食调控的EAE模型中，循环代谢物是比肠道微生物组组成更优的疾病严重程度预测因子。

**Functional validation of metabolic signatures predicting EAE severity**
为验证p-cresol和3-indoleglyoxylic酸（IGoxA）的致病性，研究人员给予自然缺乏L. reuteri的C57BL/6J小鼠通过饮水添加5 mM p-cresol或1 mM IGoxA，1周后诱导EAE并持续治疗30天。结果显示，p-cresol和IGoxA均加重了经典EAE临床评分，且p-cresol还诱发早期短暂性轴旋转型EAE（AR-EAE）症状（共济失调）。累积疾病评分（CDS）在两种代谢物处理组均显著升高。流式细胞术分析表明，p-cresol和IGoxA处理增加了脊髓中TCRβ+和TCRγδ+ T细胞的频率和数量，其中IGoxA还增加CD4+和CD8+ T细胞，两者均显著扩增IL-17产生的γδ T细胞。组织病理学评估显示，p-cresol和IGoxA均加剧小脑炎症，且p-cresol未显著加重脱髓鞘，而IGoxA则显著增加脱髓鞘。这些数据证实，p-cresol和IGoxA不仅是EAE严重程度的生物标志物，而且足以加重CNS自身免疫，促进促炎性T细胞反应和小脑病理。

总结讨论部分，研究人员指出：肠道微生物组是MS潜在的环境风险因素，其通过免疫调节代谢物影响CNS自身免疫。本研究通过纵向多组学整合，揭示了肠道微生物组背景（尤其是L. reuteri定植）对饮食反应和疾病进程的修饰作用。L. reuteri定植的微生物组更动态，且高色氨酸饮食与其协同重塑微生物组，耗竭SCFA产生菌（如Lachnospiraceae NK4A136），扩增Blautia coccoides等。多组学整合识别出胆汁酸和色氨酸代谢物-微生物聚类，其中胆汁酸可能具有保护作用，而p-cresols和indoles（如IGoxA）是疾病恶化的关键驱动因素。功能验证实验直接证明了p-cresol和IGoxA的致病性。研究结论：这项研究强调了利用多组学整合方法结合纵向研究设计理解MS的微生物组、代谢组和免疫驱动因素的价值，并表明基线肠道微生物组是修饰饮食干预策略反应的重要因素，靶向微生物代谢物或饮食-微生物组互作可能成为降低MS疾病活动的新策略。